170262. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az S-adenozil-L-metionin új kettős sóinak előállítására
170262 3 4 műszáki haladást szemléletesen tükrözik äz 1. táblázat adatai. A táblázatban az eddig ismert két legstabilabb SAM-só, azaz a klorid és a szulfát 45 C°-on száraz állapotban mért stabilitási idejét hasonlítjuk össze az új di-szulfát-di-p-toluol-szulfonát sóéval. A számadatok a minta maradék %-os SAM-tartalmát jelentik a táblázat első sorában feltüntetett idő eltelte után. 1. táblázat Anion 30 nap 60 nap 120 nap 180 nap klorid 20 szulfát 50 5 -di-szulfát-di-ptoluolszulfonát 100,1 99,9 100,2 100,4 A diszulfát-mono-p-toluolszulfonát só stabilitási adatai teljesen azonosak a diszulfát-di-p-toluolszulfonát sóéval. Az új sókat, illetve azok elegyeit a találmány szerint a következő eljárással állítjuk elő: (1) legalább 4 g/l koncentrációjú vizes S-andenozil-L-metionin-oldatot pikrolonsawal megsavanyítunk, (2) a kivált S-adenozil-L-metionin-pikrolonátot ptoluolszulfonsavra és kénsavra vonatkoztatva azonos, 0,05 és 2 közötti normalitású vizes oldat és valamely vízzel korlátozottan elegyedő szerves oldószer, célszerűen metil-etil-keton vagy n-butanol 1:1 térfogatarányú elegyében oldjuk, (3) a képződött sót vízzel teljes mértékben elegyedő rövidszénláncú alkanollal és/vagy di-(rövidszénláncűí-alkil-ketonnal leválasztjuk a vizes fázisból, (4) a kivált csapadékot 10-20 súly%-os, metanolos p-toluolszulfonsav-oldatban oldjuk, úgy, hogy SAM+ - HSO4" H 2 S04-2CH3C 6 H 4 S03H képletű kettős só előállítására 1 g csapadék oldásához 2,5-3 g oldószert, SAMf-HS0 4 --H 2 S0 4 -CU^H^SOi képletű kettős só előállítására 1 g csapadék oldásához legalább 5—6 g oldószert, a:két só keverékének előállításához pedig a fenti értékhatárok közötti mennyiségű oldószert használunk fel, és (5) az oldatból metanollal, éterrel, kloroformmal, n-propanollal, izopropanollal, n-butanollal, izobutanollal, szek-butahollal, izoamilalkohollal és/vagy tetrahidrofuránnal leválasztjuk a terméket. A kiindulási anyagként felhasznált, legalább 4 g/l koncentárciójú vizes SAM-oldatot tetszés szerinti ismert módon előállíthatjuk. Az egyik módszer szerint élesztőféleségekhez (például Saccharomyces cerevisiae-hez, Torulopsis utilishoz, Candida utilis-hoz stb.) megfelelő körülmények között [Sçhlenk: Enzymologia 29, 283 (1965)] metionint adunk, majd az elegyet szobahőmérsékleten vizes etil-acetáttal, és ezután 0,1—0,5 normál, előnyösén 0^5, normál kénsavoldattal kezeljük. E kezelés határára, a sejtek elbomlanak, és a jelenlevő SAM gyakorlatilag 100%-a oladatba jut. , .jAz.jeJegyhez a nedves sejtek súlyára vonatkoztatva előnyösen 1/20—1/5 súlyrész vizet és etil-acetátot adunk, és a sejteket 15-45 percig, előnyösen 30 percig kezeljük. Ezután az elegyhez kénsavat adunk, és 1—2 órán át, előnyösen 1,5 órán át sejtoldást 5 végzünk. Meg kell jegyeznünk, hogy az élesztősejtek szerves oldószer és híg kénsavoldat elegyével végzett oldása lényegesen kedvezőbb az általában alkalmazott, szobahőmérsékleten végrehajtott perklórsavas kezelésnél, vagy a 60 C°-on hangyasawal vagy ecet-10 savval végrehajtott oldásnál. Az eljárás nemcsak azért előnyös, mert szobahőmérsékleten is végrehajtható, ami a SAM stabilitása szempontjából rendkívül kedvező, hanem azért is, mert a fenti kezelési körülmények között olyan elegy képződik, amelyből a sejt-15 maradékok igen könnyen kiszűrhetők, és a szűrlet nem tartalmaz szennyezőanyagokat. Ismert, hogy az egyéb sejtoldási módszerek során elkerülhetetlenül szennyezőanyagok jutnak a szűrletbe, amelyek a szokásos tisztítási módszerekkel csak nagy nehézségek 20 árán különíthetők el. Egy másik eljárásváltozat szerint a SAM-ot adenozil-trifoszfátot (ATP) és metionint tartalmazó elegy enzimes kezelésével állítjuk elő. Enzimként ATP-metionin-ádenoziltranszferáz enzimet (E.C. 2.4.2.12) al-25 kalmazunk. Ezt az enzimet a továbbiakban „specifikus enzim"-nek nevezzük. E módszer ipari alkalmazhatóságának lényeges előfeltétele, hogy tiszta, és a reakcióelegytől, valamint a képződött SAM-tól könnyen elkülöníthető enzimet 30 használjuk fel. A specifikus enzimet affinitás-kromatográfiával tisztítjuk, és az enzimes reakciót megfelelő hordozóanyaghoz kötött enzimmel, oszlopkromatográfiás úton hajtjuk végre. így a fenti feltételek teljesíthetők. 35 Az enzim affinitás-kromatográfiás tisztítását úgy végezzük, hogy az enzimtartalmú oldatot — például valamely élesztőféleség vagy Escherichia coli nyers kivonatát — olyan szilárd hordozóanyaggal töltött oszlopon bocsátjuk át, ahol a szilárd hordozóanyag-40 hoz kovalens kötéssel az enzim kompetitív inhibitoraként ható csoportok kapcsolódnak. Meglepő módon azt találtuk, hogy az oszlop-töltetként igen előnyösen alkalmazhatunk aktivált poliszacharid-gélt, amelyhez kovalens kötéssel L-lizin 45 kapcsolódik. Az enzimek a szilárd hordozóanyaghoz kötött lizinmaradékokhoz való affinitása késlelteti az enzim leoldódását az oszlopról, és így az enzim igen tiszta állapotban különíthető el az egyéb fehérjéktől. 50 Azt tapasztaltuk azonban, hogy ha az így tisztított enzimet az eluátumból elkülönítve használjuk fel a következő enzimes szintézislépésben, nem jutunk megfelelő eredményre. Ez egyrészt annak tulajdonítható, hogy az egyszer már elkülönített enzim stabili-55 tása időben csökken, másrészt pedig a SAM szintéziséhez egyszer már felhasznált enzim a SAM elkülönítésének körülményei között elbomlik. Vizsgálataink szerint mindezek a hátrányok kiküszöbölhetők', ha az enzimtartalmú eluátumot megfelelő szilárd hordozóra 60 visszük fel, és az AÎP és metionin enzim-katalizált, SAM-hoz vezető reakcióját az enzimmel előkezelt hordozóval töltött oszlopon hajtjuk végre. Ezzel az eljárásmóddal kitűnő eredményeket érhetünk el. Szilárd hordozóanyagként előnyösen valamely, a 65 fehérjék kötődését elősegítő reagenssel, például bróm-. 2^
