170262. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az S-adenozil-L-metionin új kettős sóinak előállítására
170262 5 6 ciánnal előaktivált poliszaccharidokat alkalmazhatunk. Ha az ATP és a metionin megfelelő pufferoldattal készített oldatát átbocsátjuk az oszlopon, az oszlop alján SAM-tartalmú eluátumot különíthetünk el. A találmány szerinti eljárás (1) lépésében a SAM-ot igen tiszta állapotban különíthetjük el. Amint az Anal. Biochem. 4,16-28 (1971) szakcikkben ismertetett vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatokból kitűnik, savas közegben pikrolonsawal egyedül és kizárólag SAM választható le. Ennek megfelelően a pikrolonsav meglepően szelektív lecsapószer. Az eddig felhasznált más lecsapószerek, például pikrinsav, Reinecke-só vagy bórsav nagymértékben szennyezett csapadékok leválásához vezettek, amelyekből csak ioncserés oszlopkromatográfiás utótisztítással lehetett megfelelő minőségű SAM-ot elkülöníteni. Ez a tisztítási müvelet rendkívül költséges, és ipari méretekben csak nagy nehézségek árán valósítható meg. Teljesen tiszta terméket még ezzel a bonyolult tisztítási művelettel sem lehet minden esetben előállítani. A pikrolonsav vizes vagy a korábban felsorolt szerves oldószerekkel képezett oldatának alkalmazásával ezek a problémák kiküszöbölhetők. További előnyt jelent, hogy az eljárás szobahőmérsékleten könnyen végrehajtható. A találmány szerinti eljárás (2) lépésében általában p-toluolszulfonsavra és kénsavra vonatkoztatva egyaránt 0,05-0,2 normál, előnyösen 0,1 normál vizes oldatot, és vízzel korlátozottan elegyedő szerves oldószerként előnyösen metil-etil-ketont vagy n-butanolt alkalmazunk. A szerves oldószer alkalmazásával egyrészt a vizes savoldat mennyiségét minimumra csökkenthetjük, másrészt a pikrolonsavat gyakorlatilag teljes mértékben eltávolíthatjuk. A találmány szerinti eljárás (3) lépésében előnyösen a vizes oldat térfogatára vonatkoztatva 4—8 térfogatrész szerves oldószert, célszerűen acetont, metanolt, etanolt vagy propán olt használunk fel. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy ha a találmány szerinti eljárás (4) lépésében csak a (3) lépésben kapott csapadék feloldásához minimálisan szükséges mennyiségű 2,5-3 g/l g csapadék metanolos p-toluolszulfonsav-oldatot használjuk fel, az (5) lépésben SAM*-HSOi" -HjSO^CHsCsr^SOsH képletű kettős só válik le. Abban az esetben azonban, ha az e) lépésben a minimálisan szükségesnek legalább kétszeresét kitevő mennyiségű metanolos p-toluolszulfonsav-oldatot használunk fel, az (5) lépésben SAMf -HS0 4 "-H 2 S04 -CHsCét^SOs H képletű kettős sót kapunk. E két értékhatár közé eső metanolos p-toluolszulfonsav-oldat mennyiségek alkalmazása esetén a két kettős só elegyeihez jutunk. Az (5) lépésben az új sók leválasztásához szerves oldószerként metanolt, étert, kloroformot, n-propanolt, izopropanolt, n-butanolt, izobutanolt, szekbutanolt, izoamil-alkoholt vagy tetrahidrofuránt használunk fel. A találmány szerinti eljárással előállított SAM kettős sók száraz állapotban korlátlan ideig eltarthatok anélkül, hogy gyakorlatilag számottevő változást szenvednének. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertet-, jük. Az eljárás egyik lépésében sincs szükség szobahőmérsékletet meghaladó hőmérséklet alkalmazására. Valamennyi műveletet savas körülmények között hajtunk végre, ami a SAM bomlásának megakadályozása szempontjából elengedhetetlen feltétel. A talál-5 many szerinti eljárás nem igényel bonyolult műveleteket - például ioncserés vagy aktív szénen végzett kromatografálást -, ami az eljárás ipari megvalósítását megnehezítené. 10 1. példa 90 kg, Schlenk [Enzymologia 29, 283 (1965)] módszerével SAM-ban dúsított élesztőhöz (SAM-tartalom: 6,88 g/kg) szobahőmérsékleten 11 liter etilacetátot és 11 liter vizet adunk. Az elegyet 30 percig 15 erélyesen keverjük, majd 50 liter 0,35 n kénsavoldatot adunk hozzá, és további 1,5 órán át keverjük. A szilárd anyagot leszűrjük és vízzel mossuk. 140 liter oldatot kapunk, amely literenként 4,40 g SAM-ot tartalmaz. Ez a mennyiség az eredeti SAM-tartalomra 20 99,5%-ának felel meg. Az így kapott oldathoz keverés közben 2,3 kg pikrolonsav 25 liter metil-etil-ketonnal készített oldatát adjuk. Az elegyet éjszakán át állni hagyjuk, majd a csapadékot centrifugálással elkülönítjük és vízzel mos-25 suk. A kapott szilárd anyagot keverés közben 18 liter, kénsavra és p-toluolszulfonsavra vonatkoztatva egyaránt 0,1 normál vizes oldat és 18 liter metil-etilketon elegyéhez adjuk. Az elegyet állni hagyjuk, majd 30 a szerves fázist elválasztjuk, és a pikrolonsav-regeneráló berendezésbe juttatjuk. A vizes fázist a pikrolonsav nyomainak eltávolítása érdekében kevés metiletil-ketonnal kezeljük, majd csontszénnel derítjük és szűrjük. 35 16,5 liter oldatot kapunk, amely literenként 33,8 g SAM-ot tartalmaz. Ez a mennyiség az élesztőben eredetileg jelenlevő SAM 90%-ának felel meg. Az oldatot az Anal, Biochem. 4,16-28. (1971) szakcikk előírásai szerint vékonyréteg kromatográfiás elemzés-40 nek vetjük alá. Az elemzés szerint az oldat kizárólag SAM-ot tartalmaz, és a SAM bomlástermékei, vagy más szerves bázisok még nyomokban sem mutathatók ki. A kapott oldatot keverés közben 100 liter acetonba öntjük. Az elegyet egy ideig állni hagyjuk, 45 majd az oldószert dekantálással elválasztjuk, és a szilárd anyagot 3,3 kg 15%-os metanolos p-toluolszulfonsav-oldatban oldjuk. Az oldathoz csontszenet adunk, majd szűrjük, és a szűrletet 25 liter dietiléterbe öntjük. 50 1184 g kristályos, könnyen szűrhető, nem túlzottan higroszkópos terméket kapunk. A termék vízben jól oldódik (telített vizes oldata 20%-osnál nagyobb koncentrációjú), és átlátszó oldatot képez. A só metanolban és etanolban gyengén oldódik, aceton-55 ban, metil-etil-ketonban, kloroformban, hosszabb szénláncú alkoholokban és benzolban oldhatatlan. A termék az Anal. Biochem. 4,16-28. (1971) szakcikkben ismertetett vékonyréteg kromatográfiás elemzés szerint szennyezést nem tartalmaz. 60 Elemzés a C29 H42N 6 Oi9S 5 képlet alapján (M = = 938,98): számított: C: 37,09%, H:4,51%, N: 8,95%, S: 17,07%, talált: C: 36,39%, H:4,6%, N:8,8%, 65 S: 16,7%. 3
