170252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kancerostatikus és immunstimuláló hatású 1,3-diaza-biciklo (3,1,O(hexénszármazék előállítására
170252 3 4 hidroxidot csepegtetünk. Néhány perc múltán 0,66 g (6 mmol) 4-imino-l,3-diazabiciklo[3,l,0]hexan-2-on válik ki, ami az elméletire vonatkoztatva 60%-os hozamnak felel meg. A vízmentes metil-alkoholból végrehajtott átkristályosítás után a vegyület 250 C° feletti hőmérsékleten bomlik. A vegyület KBr-ban felvett infravörös színképe két széles sávot mutat 3300-2500 cm"1 és 1800-1400 cm"1 között, élesebb sávokat pedig például 1295 cnr'-nél, 1232 cm^-nél 1178 cm^-nél, 1013 cm-1 -nél, 922 cm _1 -nél, 855 cm" 1 -nél, 820 cm-nél, 682 cm-1 -nél, valamint 542 cm-1 -nél. A tömegspektrum 11 I-nél molekulacsúcsot, 110-nél, 83-nál, 68-nál és 4I-nél pedig csúcsokat mutat. Az NMR-spektrum (deuterodimetilformamidban) az alábbi sávokat mutatja: Kémiai eltolódás TMS-sel Csatolási állandók szemben, ppm-ben H2 -ben, T (1) = 2,23 J (1,2) 0,5 T (2) = 2,51 J (1,3) 2,93 T (3) = 3,47 J (2,3) 5,27 A mikroelementáranalízis az alábbi értékeket ajda a C4 H 5 ONj összegképlet alapján: talált: C 42,62 H 4,03 N 37,52%, számított: C 43,23 H 4,53 N 37,82%. A találmány szerinti eljárással előállítható új vegyület gyógyászati tulajdonságait az alábbiak szerint határozzuk meg: 1. Kancerostatikus (rákgátló) hatás 80-120 g egyedi súlyú és 6—8 hetes Sprague-Dawley-patkányokat a tarkón ráksejtekkel szubkután oltunk be. Az átoltáshoz minden esetben a Walker 256 karcinoszarkoma (szolid, patkány) kb. 106 tumorsejtjének 0,1 ml mennyiségű vizes szuszpenzióját használjuk. 4-imino-l,3 -diaza-biciklo[3,l,0]hexán-2-on-t fiziológiás konyhasóoldatban oldunk (a mindenkor szükséges mennyiség a kísérleti állat testsúly-kilogrammjára vonatkoztatva 5 ml oldat). Az így kapott oldatot az átoltást (inokulációt) követően, 6 óra múltán intravénásán vagy nyelőcsőszonda segítségével, orálisan adjuk a kísérleti állatoknak. A kontrollállatok 5 ml/kg fiziológiás konyhasóoldatot kapnak. Kísérletenkint 20 kísérleti és 20 kontrollállatot használunk. Az állatokat 10 nap elteltével éterrel megöljük, a daganatokat kihámozzuk, és egybevetjük a kontrollállatok daganatsúlyait a kísérleti állatokéival. Az alábbi táblázatban közölt adatok jól mutatják, hogy a tumor növekedését az intravénásán és perorálisan adott anyag egyaránt szignifikáns módon gátolja. 1. táblázat Walker 256 szarkoma növekedésének gátlása 4-imino-l ,3-diaza-biciklo[3,l ,0]hexán-2-on egyszeri alkalmazása esetén Sprague-Dawley-patkányon ^te Az alkalmazás módja Mennyiség, mg/kg Gátlás, % i.v. 0,1 7,5 1,0 17,5 10,0 49,5 100,0 31,0 Az alkalmazás módja Mennyiség, mg/kg Gátlás, % 5 200,0 39,5 p.o. 5,0 20,0 125,0 62,0 10 2. Immunstimuláló hatás Az 5 ml fiziológiás konyhasóoldatban oldott hatóanyagot intravénásán, farokvénába adjuk 8 darab, 200—250 g átlagsúlyú Sprague-Dawley-patkánynak. Kontrollálatként ugyancsak 8 hasonló állatot haszná-15 lünk, amelyeknek azonban csak 5 ml pro testsúly kg fiziológiás konyhasóoldatot adunk. A következő napokban a farokvénából 1—2 csepp vért veszünk, és meghatározzuk az alakos véralkotókat. A nyolc egyednél kapott értékekből a középértékeket statisz-20 tikusan határozzuk meg. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a fehérvérsejtek (leukociták) száma erősen növekszik, és a nyiroksejtek (limfociták) százalékos aránya is emelkedik. A kísérleti állatok csak 20—25 nap elteltével 25 érik el a kontrollállatoknál mért értékeket. A vörösvértestek (eritrociták) száma viszont a kísérlet teljes tartama alatt sem emelkedik szignifikánsan. A legnagyobb növekedésnek megfelelő harmadik nap kísérleti eredményeit az alábbi 2. táblázatban foglaltuk össze: 30 2. táblázat A fehérvérsejtszám emelkedése Sprague—Dawleypatkánynál a 4-imino-l ,3-diaza-biciklo[3,l ,0]hexán-2-on egyszeri i.v. adása utáni harmadik napon 35 'mg hatóanyag/kg patkány Fehérvérsejtszám/mm3 0 7 300 2 10 300 5 9 800 10 10 800 20 12 300 40 10 800 75 11800 150 8 000 400 6 500 A fentieken kívül Jerne módszerével [Jerne és munkatársai, Science 140, 1963, 405. lap] meghatá-50 rozzuk az antitestképző lépsejtek számát is. 20 fehér, 20-25 g testsúlyú hímegeret l-l ml tartósított juh vörösvértesttel immunizálunk (1 ml 5 X 108 vörösvértestet, eritrocitát tartalmaz). Még aznap i.v. beadjuk a testsúlykilogrammonként 5 ml 55 fiziológiás konyhasóoldatban oldott 4-imino-l,3-diaza-biciklo[3,l,0]hexán-2-on-t, illetve az összehasonlító kísérletben vizsgált egyéb hatóanyagokat. Kontroll céljára ugyancsak 20 állatot hasonlóképpen l-l ml juheritrocitával immunizálunk, majd azokat 5 ml/ kg 60 fiziológiás konyhasóoldattal kezeljük. Három nappal a kezelés után steril körülmények között kiemeljük az állatok lépet, és Jerne módszerével meghatározzuk az antitestképző lépsejtek számát. Az egyedi értékekből középértéket számolunk. Az egyes adatokat a 3. 65 táblázatban foglaltuk össze. 2
