170225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pepszinosztreptin proteáz- inhibitorok előállítására
170225 11 12 szingátló vizsgálatot kombinálva azt találjuk, hogy ez a kultúra legalább két különböző pepszin-inhibitort tartalmaz. (2) Elemzés A vékonyréteg-kromatográfiai etilacetát-metanol 5 (4:1) oldószerrendszer alkalmazásával végezzük el a mintán, majd az oldószert elpárologtatjuk a lemezről, így szárazlemezt kapunk. Eközben 3%-os vizes agaroldatot készítünk és 1:1 térfogatarányban összekeverjük 0,4%-os 2,0 pH-értékü kazein-oldattal. Az elegyet 10 50 C°-ra hűtjük, ezután kristályos pepszint adunk az oldathoz, így a pepszinkoncentráció 2 mg/100 ml elegy ezután a keverést gyorsan folytatjuk. Ezután az elegyet Petri-csészébe visszük át és rövid ideig állni hagyjuk, miközben elkészítjük a 2—3 mm 15 vastagságú kazein-pepszin-agarlemezt. A fenti módon készített száraz vékonyréteget ráhelyezzük erre az agarlemezre és az egészet körülbelül 10 percen keresztül hidegen tartjuk, hogy a vékonyrétegen képződött aktív faktorok behatolhassanak az agárba. Ezután a 20 vékonyréteget lehúzzuk és az agarlemezt éjszakán át 37 C°-on állni hagyjuk. Az agarlemez átlátszóvá válik a pepszint proteohtikus hatása következtében, ha azonban pepszint gátló anyag van jelen, az agar opálos és zavaros marad. így ez a módszer jól kimutatja a 25 pepszin inhibitorok jelenlétét. Ezzel a módszerrel két inhibitort mutatunk ki, amelyek különálló foltokat képeznek, amelyeknek Rf-értéke 0,75—0,85, illetve 0,4—0,5 a fenti oldószerrendszerrel futtatott vékonyréteg-kromatogramon. 30 így két anyagot különítünk el és egymást követően tisztítjuk. Először a fenti kultúra pH-ját sósavval 4-re állítjuk be, majd szűrőprés segítségével szűrjük. A szürlet pH-ját nátrium-hidroxid-oldattal 8-ra állítjuk be, majd 300 000 térfogatrész n-butanollal extraháljuk. Az n-butanolos fázist betöményítjük egytizedére, majd aktív szénnel kezeljük. A szenet kiszűrjük, a szűrletet szilikagél oszlopon futtatjuk és az aktív frakciót etilacetát-metanol (4:1) eleggyel oldjuk le. Az összes aktív frakciót összegyűjtjük, betöményítjük és szilikagél oszlopon a fenti körülmények között kromatografáljuk; így I és II aktív frakciókat különítünk el. Az I frakciót betöményítjük és a koncentrátumot szilikagél oszlopon kromatografáljuk benzol-metanol-ecetsav (90:10:1) oldószer eleggyel. Az így kapott aktív frakciót betöményítjük és aktív szén oszlopon futtatjuk. 60%-os vizes metanollal végzett mosás után az aktív frakciót metanollal eluáljuk és az eluátumot betöményítjük. Ezt a koncentrátumot Sephadex LH—20 (Pharmacia Fine Chemicals) oszlopon futtatjuk és az aktív frakciót metanollal eluáljuk. Az eluátumot betöményítjük és állni hagyjuk, így 0,1 súlyrész terméket kapunk (I) fehér színű tűk alakjában. Eközben a II frakciót az I frakcióhoz hasonló körülmények között tisztítjuk oszlopkromatográfiával szilikagél és aktív szén oszlopokon, így 0,41 súlyrész terméket kapunk (II) fehér tűk alakjában metanolos oldatból. Ezeknek a termékeknek az Rfértéke a fenti vékonyréteg-kromatogramon 0,75-0,85 az I és 0,4-0,5 a II jelzésű termék esetén. Az alábbi 4. táblázatban az I, II és II-metilészter különböző fizikai-kémiai adatait adjuk meg, a Il-metilésztert a II jelzésű vegyület diazometánnal végzett kezelésével állítjuk elő. Ezeknek a vegyületeknek az infravörös abszorpciós spektrumát ábrázolja a 7. ábra. 4. táblázat Az I, II és II-metilészter jelzésű vegyületek fizikai-kémiai tulajdonságai I II II-metilészter Olvadáspont Elemzési eredmények 270-272 C" -91° (0,25%, metanol) (C34H63 N S 0 9 ) Számított C 59,56%, H 9,20%, N 10,22%, Talált C 59,50%, H 9,16%, N 10,03%, Ezekből az adatokból és az 1. példában leírt különböző analitikai eljárásokkal végzett kísérletek eredményeiből kitűnik, hogy a II jelzésű termék pepszinosztreptin, ezt kapjuk az 1. példában. Másrészt azt találjuk, hogy az I jelzésű termék alapvető aminosavaiban és zsírsavaiban teljesen megegyezik a II jelzésű vegyülettel. Az I jelzésű termék molekulaképlete az elemzési eredmények alapján (4. táblázat) C34H63N 5 09, ez 1 szénatommal és 2 hidrogénatommal tér el a II jelzésű vegyülettől, amelynek képlete C33 H 61 N 5 0 9 . Ezekből a kísérletekből kitűnik, hogy az I jelzésű termék a II jelzésű termék metilésztere. 237-239 C° -95° (0,5%, metanol) (C33 H 61 N s 0 9 ) C 59,02%, H 9,09%, N 10,43%, C 58,50%, H 9,14%, N 10,51%, 271-273 C° -85° (0,5%, metanol) (C^H^NsO,) C 59,56%, H 9,20%, N 10,22%, C 59,21%, H 9,16%, N 9,71%. A pepszint gátló aktivitás (IDS0 ) az I jelzésű kristályok esetén 0,054 jug és a II jelzésű kristályok 55 esetén 0,045 jug. 3. példa 200 térfogatrész térfogatú lombikban levő 30 térfogatrész 7,0 pH-értékű folyékony táptalajt, amely 60 5% dextrint, 3% szójalisztet, 0,7% peptont, 0,5% kalcium-karbonátot, 0,05% ferroszulfátot, 0,05% mangánszulfátot, 0,05% magnéziumszulfátot, 0,05% dikáhumfoszfátot és különböző koncentrációkban DL-valint, L-valint, D-valint, N-acetil-DL-valint 65 vagy N-benzoil-DL-valint tartalmaz, Streptomyces 6
