170225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pepszinosztreptin proteáz- inhibitorok előállítására
170225 10 táptalaj 1% glükózt, 0,7% peptont, 0,3% húskivonatot, 0,3% nátrium-kloridot és 0,2% dikálium-foszfátot tartalmaz, valamint 30 súlyrész habzásgátlószert, a fermentort levegőztetés és keverés közben 5 napon keresztül inkubáljuk 28 C°-on. A keletkező kultúrát szűrőprésen keresztül szűrjük szűrő segédanyagként diatómaföldet használva; a keletkező szűrletet körülbelül 15 000 térfogatrész etilacetáttal kezeljük. Az etilacetátos fázist eldobjuk és a vizes fázist kétszer extraháljuk egyenként 30 000 térfogatrész n-butanollal. Az n-butanolos extraktumot betöményítjük és a koncentrátumot feloldjuk 3 000 térfogatrész metanolban. Az oldatot átbocsátjuk 500 térfogatrész aktív szenet tartalmazó oszlopon és 7500 térfogatrész eluátumot gyűjtünk össze. Ezt betöményítjük, így 13 súlyrész por alakú terméket kapunk. Ezt a por alakú terméket etil-acetáttal alaposan kimossuk, a mosófolyadékokat eldobjuk és a maradékot 50% metanolban feloldjuk. A metanolos oldatot 500 térfogatrész aktív szénből álló oszlopon visszük keresztül, az oszlopot 1500 10 15 20 térfogatrész 50%-os metanollal mossuk, az aktív frakciót 2000 térfogatrész metanollal eluáljuk, az eluátumot betöményítjük, így 11 térfogatrész fehér színű port kapunk. Ezt az alábbi módon tisztíthatjuk. A por 0,15 súlyrész mennyiségét kis mennyiségű n-butanol-ecetsav-víz-butilacetát (30:1:1:30) oldószerrendszerben feloldjuk, az oldatot szilikagél oszlopra (967 térfogatrész, belső átmérő-magasság aránya 4:77) visszük fel és az aktív frakciókat ugyanazzal az oldószerrel eluáljuk. Az első frakciót (1000 térfogatrész) eldobjuk és a következő 300 térfogatrész (ez felel meg a pepszinosztreptin aktív frakciójának) és 150 térfogatrész frakciót (ez felel meg a P-pepszinosztreptin aktív frakciójának) 1600 térfogatrész oldószerrel való elúció után összegyűjtjük és szárazra pároljuk. A koncentrátumokat metanolban feloldjuk és szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ekkor pepszinosztreptin és P-pepszinosztreptin válik le fehér tűk alakjában. A kristályokat metanolból ismételten átkristályosítjuk, a végső kristályos termékmennyiség 0,025, illetve 0,01 súlyrész. (2) A kapott kristályos termék elemzése A kapott kristályos termékeket különböző fizikaikémiai elemzésekkel vizsgáljuk meg. 3. táblázat A pepszinosztreptin és P-pepszinosztreptin fizikai-kémiai tulajdonságai Pepszinosztreptin P-pepszinosztreptin Olvadáspont W2 D S Elemzési eredmények Uv-spektrum IR-spektrum MMR-spektrum A metilészter tömegspektruma IDS o pepszinnel szemben (5 jug) Komponensek 236-238 C° -91,5° (0,53% metanol) C 59,12%, H 9,34%, N 10,59%. nincs abszorpciós maximum 210—400 nut-on lásd 1. ábra lásd 3. ábra lásd 5. ábra molekuláris ion csúcs: 685 m/e 0,048 /ig alanin: valin: 4-amino-3-oxi-6-metilheptánsav= 1:2:2 kb. 1,1 mg izobutilsav 10 mg kristályból 210-212 C° -92,9° (0,49% metanol) C 57,53%, H 9,05%, N 10,52%. nincs abszorpciós maximum 210—450 írux-on lásd 2. ábra lásd 4. ábra lásd 6. ábra molekuláris ion csúcs: 671 m/e 0,05 Mg alanin: valin. 4-amino-3-oxi-6-metil-heptánsav= 1:2:2 kb. 1,0 mg propionsav 10 mg kristályból 2. példa (1) Előállítás 200 térfogatrész térfogatú lombikban levő 30 térfogatrész 7,0 pH-értékű folyékony táptalajt, amely 3% glükózt, 2% kukoricalekvárt, 0,05% dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,02% ammónium-szulfátot, 0,05% magnézium-szulfátot és 0,5% kalcium-karbonátot tartalmaz, Streptomyces citricolor Ferm-P-No. 393(ATCC 21 925) törzzsel inokulálunk és a közeget rotációs rázógépen 2 napon keresztül inkubáljuk 28 C°-on. A keletkező kultúrát 2000 térfogatrész térfogatú lombikba visszük át, amely 500 térfogatrész ugyanolyan összetételű közeget tartalmaz és a lombikot rázógépen 2 napon át inkubáljuk 28 C°-on. A keletkező kultúrát 50 000 térfogatrész térfogatú fermentorba visszük át, amely 30 000 súlyrész ugyanolyan összetételű táptalajt tartalmaz, valamint valamely habzásgátló szert is. Az inokulált közeget 2 50 napon át inkubáljuk 28 C°-on keverés és levegőztetés közben. Az így kapott kultúrát használjuk fel 2 000 000 térfogatrész térfogatú fermentorban levő 1 000 000 térfogatrész 7,0 pH-értékű folyékony táptalaj inoku-55 lálásához, amely táptalaj 1% glükózt, 3% peptont, 0,7% húskivonatot, 0,3% nátrium-kloridot és 0,2% dikálium-foszfátot, valamint körülbelül 500 súlyrész habzásgátló szert tartalmaz, az inokulált közeget levegőztetés és keverés közben 3 napon át inkubáljuk 60 28 C°-on, így körülbelül 1 000 000 térfogatrész kultúrát kapunk. Ennek a kultúrának a pepszint gátló aktivitása pepszinosztreptinre vonatkoztatva 10,5 Mg/ml, azonban vékonyréteg-kromatográfiát és az alábbiakban 65 ismertetett kazein-pepszin-agarlemezt használó pep-5
