170225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pepszinosztreptin proteáz- inhibitorok előállítására

3 170225 Streptomyces «tricolor Ferm-P No. 393 (ATCC 21 925) és Streptomyces catenulae IFO 12 848 (ATCC 12 476). Az „IFO", „ATCC" és „Ferm-P" jelzések utáni 5 számok az Institute for Fermentation, Osaka, Japán, az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA es a Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, Japán, intézet deponálási számát jelentik. 10 A mikroorganizmusokat az alábbi módon vizsgáltuk meg. A, Streptomyces faj mikroorganizmusait folyékony táptalajban termeltük és a pepszint gátló aktivitást az egyes kultúrák esetében kazein-pepszin agarlemezen határoztuk meg. A pepszinosztreptineket 15 termelő törzseket a fenti nagy gátló aktivitású törzsek közül választjuk ki. A találmány szerinti eljárásban a pepszinosztreptineket termelő törzset táptalajban tenyésztettük. A táptalaj folyékony vagy szilárd lehet, általában rázott 20 kultúra vagy kevert aerob kultúra a legmegfelelőbb. A táptalaj összetétele olyan, hogy az alkalmazott törzs az említett proteáz-inhibitort felhalmozhassa, így a táptalaj szénforrásként glükózt, glicerint, keményítőt, szacharózt, dextrint, melaszt, szerves sava- 25 kat stb. és nitrogénforrásként peptont, protein hidrolizátumot, például kazaminsavat (Difco Laboratories), N—Z-amint (Sheffield Chemical), húsextraktumot, élesztőextraktumot, szójababpogácsát, kukoricalekvárt, aminosavakat, ammóniumsókat, nitrátokat és 30 egyéb szerves és szervetlen nitrogéntartalmú vegyületeket tartalmazhat. Szervetlen sóként különböző foszfátokat, mafmézium-szulfátot, nátrium-kloridot stb. tartalmazhat. Ezenkívül a táptalajhoz a mikroorganizmusok növekedésének elősegítésére vitaminokat és 35 nukleinsav-származékokat adagolhatunk. A találmány alapja továbbá az a felismerés, hogy ha a táptalaj valint, N-acilvalint és/vagy izovajsavat tartalmaz, jelentősen megnő a pepszinosztreptin és/vagy pepszinosztreptin-metilészter felhalmozódása és ha a táptalaj- 40 hoz propionsavat adunk, a pepszinosztreptin-P és/vagy annak metilésztere halmozódik fel nagyobb mértékben. Az N-acil-valin N-acilcsoportja például N-acetil- és N-benzoilcsoport lehet. Ezeknek az adalékoknak a mennyisége körülbelül 0,25—5,0%, előnyö- 45 sen körülbelül 2—4% valin és N-acil-valin esetében, körülbelül 0,25-2,0, előnyösen körülbelül 0,5-1,0% jzovajsav esetében és körülbelül 0,25—5,0%, előnyösen körülbelül 0,5—3,0% propionsav esetében. Az izovajsavat és propionsavat nátrium- vagy káliumsó 50 alakjában adagolhatjuk. Ezeket az adalékokat hozzáadhatjuk a táptalajhoz a tenyésztés kezdetekor vagy számos egyéb időpontban a tenyészidő folyamán. Ha a mikroorganizmusokat ezeknek az adalékanyagoknak a jelenlétében termeljük, a pepszinosztreptinek 55 felhalmozódott mennyisége körülbelül 10-20-szorosra növelhető. A pepszinosztreptinek kitermelését növelhetjük azáltal is, hogy a táptalajhoz valamely habzásgátló szert adunk, így szilikonolajat, polipropilénglikol-szár- 60 mazékot vagy szójababolajat. A mikroorganizmus termelése során előnyös, ha először kis méretű előkultúrát készítünk, majd a fermentációs táptalajt a keletkező előkultúrával oltjuk be. A termelés körülményeit, ideértve a hőmér- 65 sékletet és az inkubalas időtartamát, a táptalaj pH-értékét stb. úgy választjuk meg és úgy szabályozzuk, hogy a. pepszinosztreptinek maximális mennyiségben halmozódjanak fel. Sok esetben előnyös, ha a törzset aerob körülmények között termeljük körülbelül 20-35 C°-on 1-6 napon keresztül, miközben a táptalaj pH-értékét körülbelül 4 és 9,5 között tartjuk. A keletkező táptalaj pepszinosztreptineket tartalmaz. Ha folyékony táptalajt alkalmazunk, a pepszinosztreptin(ek) túlnyomórészt a folyékony fázisban halmozódik(nak) fel. Ezért ajánlatos, ha a micéliumot szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk a táptalajtól, majd a pepszinosztreptineket a keletkező szűrletből vagy felső rétegből választjuk el, bár a terméket (termékeket) adott esetben a micélium előzetes eltávolítása nélkül is kinyerhetjük. A tennék táptalajból való elkülönítését és uszítását könnyen megvalósíthatjuk különböző, alkalmasan megválasztott eljárásokkal, az eljárások kombinációja a pepszinosztreptinek kémiai jellemzőitől függ. így alkalmazhatunk például lecsapást is, lecsapószerként például ammónium-szulfátot alkalmazva, olyan szerves oldószerrel végzett extrakciót, amely nem elegyedik vízzel és amelyben a pepszinosztreptinek oldódnak, például n-butanolt, nagyon poláris oldószerben végzett feloldást, oldószerként metanolt vagy etanolt alkalmazva, a szennyeződéseket eltávolíthatjuk például etil-acetáttal vagy hexánnal végzett kezeléssel, alkalmazhatunk ezenkívül gélfiitrációt különböző típusú dextrán gyöngyökkel, például Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals) vagy azzal egyenértékű anyaggal; ioncserélő kromatográfiát különböző ioncserélőkkel így ioncserélő gyantával, ioncserélő cellulózzal, ioncserélő Sephadexszel (Pharmacia Fine Chemicals), abszorpciós kromatográfiát különböző adszorbenseken, például aktív szénen, alumínium-oxidon, szilikagélen vagy makromolekulám adszorbenseken, például Amberlite XAD-1 és 2 (Rohm und Haas) adszorbensen. Az említett eljárásokon kívül természetesen egyéb tisztító eljárást is használhatunk a pepszinosztreptinek tulajdonságainak megfelelően. Ha ezeket az eljárásokat megfelelő kombinációban alkalmazzuk, a pepszinosztreptineket kristályos alakban különíthetjük el a táptalajtól. A pepszinosztreptint, P-pepszinosztreptint és azok métilésztereit külön-külön kimutathatjuk kazein-pepszin-agarlemezen szilikagélen készített, megfelelő oldószerrendszerrel kifejlesztett vékonyréteg-kromatográfía után. Az ilyen oldószerrendszerek példái és a négy pepszinosztreptin Rf-értéke ezeknek az oldószerrendszereknek az esetében az alábbi. 1. Táblázat Pepszinosztreptin RF-érték A B oldószerrendszerben pepszinosztreptin P-pepszinosztreptin pepszinosztreptinmetilészter P-pepszinosztreptinmetilészter 0,40-0,50 0,35-0,45 0,75-0,85 0,73-0,83 0,55-0,65 0,40-0,50 0,68-0,78 0,56-0,66 2