170225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pepszinosztreptin proteáz- inhibitorok előállítására
170225 A) oldószerrendszer: etilacetát-metanol (4:1) B) oldószerrendszer: n-butanol-ecetsav-víz-n-butilacetát (20:1:1:20) így kétdimenziós, szilikagélen készített vékony- 5 réteg-kromatográfiával, A és B oldószerrendszerek használatával a pepszinosztreptineket elválaszthatjuk. A pepszinosztreptinek bármelyikét a fenti kimutatás elve alapján különíthetjük el a több pepszinosztreptint tartalmazó oldatból. így például a négy 10 pepszinosztreptin elegyéből bármelyik komponenst úgy választhatjuk el, hogy két, egymás után kapcsolt oszlopon végzünk kromatográfiás elválasztást: (1) Először a pepszinosztreptint és P-pepszino- 15 sztreptint választjuk el azok metilésztereitől szilikagélen végzett oszlopkromatográfiával, eluálószerként etilacetát-metanol (5:1) rendszert alkalmazva, majd (2) a pepszinosztreptint és P-pepszinosztreptint 20 vagy pedig a pepszinosztreptin-metilésztert és P-pepszinosztreptin-metilésztert szilikagéllel végzett oszlopkromatográfiával választhatjuk el egymástól eluálószerként n-butanol-ecetsav-víz-n-butilacetát (30:1:1:30) rendszert használva. 25 A pepszinosztreptin és P-pepszinosztreptin elválasztására a második lépésben makromolekuláris adszorbensen végzett oszlopkromatográfiát használhatunk, ez az adszorbens például Amberlite (XAD—2 (Rohm und Haas) lehet, és eluálószerként lúgos 30 metanol-oldatot alkalmazhatunk. A fenti eljárással előállítható pepszinosztreptinek kémiai szerkezetét különböző kémiai és fizikokémiai elemzések segítségével állapítottuk meg. Ezeket az elemzéseket a példákban írjuk le, a képlet a 1. oldalon 35 megadottal egyezik meg. A fenti képletben R1 etil- vagy izopropilcsoportot és R2 hidrogénatomot vagy metilcsoportot jelent és az egyes szerkezetek és a pepszinosztreptinek közötti viszony az alábbi: 40 0,1 ml, 50 jug/ml koncentrációjú kristályos pepszint (Sigma Chemical Company). A keletkező 2 ml térfogatú elegyet 30 percen keresztül 37 C°-on inkubáljuk. Ezután a reakciót 2,0 ml 1,7 m perklórsav-oldat hozzáadásával leállítjuk. Az elegyet 30 percen keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd szűrőpapíron szűrjük. A szűrlet abszorpcióját (A) 280 m/non mérjük. Emellett kontrollként elkészítjük ugyanezt a rendszert, amely azonban nem tartalmaz pepszinosztreptineket, és a fenti módon meghatározzuk az abszorpciót (B). Ezután egy kalibrációs görbéből meghatározzuk az (A) és (B) reakciórendszerek maradék pepszin koncentrációját —(C) és (D) —, majd az alábbi egyenlet segítségével kiszámítjuk a minta proteázt gátló aktivitását: Rí R2 pepszinosztreptin izopropil hidrogén izopropil metil etil hidrogén P-pepszinosztreptin etil metil P-pepszinosztreptin-metil- 45 észter pepszinosztreptin pepszinosztreptin-metilészter 50 Mint a fenti szerkezeti képletekből kitűnik, a pepszinosztreptin és P-pepszinosztreptin sav és így könnyen alakítható fémsókká, így nátrium-, kálium-, kalcium- és alumíniumsókká. A leírásban a „pepszinosztreptin" és „proteáz-inhibitor" kifejezés ezeket a 55 sókat is magában foglalja. A pepszinosztreptineket az jellemzi, hogy erősen gátolják a pepszin és egyéb savas proteázók aktivitását. A pepszint gátló aktivitást az alábbi kísérlettel határoztuk meg. 60 1,9 ml, 1,0 ml 0,6%-os kazein szubsztrátumból, amelyet 0,08 m tejsavval készítettünk, 0,7 ml 0,02 n sósavas 0,02 m kálium-klorid pufferből (pH = 2,0) és 0,2 ml pepszinosztreptineket tartalmazó mintát tartalmazó oldatból álló reakcióelegyhez hozzáadunk 65 %-os gátlás = D-C D 100 A fenti eljárás szerint az 5 /ig kristályos pepszin aktivitásának 50%-os gátlásához szükséges pepszinosztreptin mennyiség (Dso ) az összes pepszinosztreptin esetében körülbelül 0,05 jug. A pepszinosztreptinek a Rhizopus chinensis (Seikagaku Kogyo, K.K.) és Trametes sanguinia (Takeda Chemical Industries, Ltd.) savas proteáz aktivitását is gátolják. A vizsgálatot a fenti módon végezve és 0,6%-os, 0,05 m tejsavval készített kazein-oldatot és 0,05 m tejsavas puffert (pH = 3,0) használva, 10 ju Rhizopus chinensis savas proteáz aktivitásának 50%os gátlásához szükséges mennyiség körülbelül 0,05 //g és 20 /ig Trametes sanguinia savas proteáz aktivitásának 50%-os gátlásához szükséges pepszinosztreptin mennyiség körülbelül 0,25 jug mindegyik pepszinosztreptin esetén. , A pepszinosztreptinek toxicitása nagyon alacsony, LDK) -érték egéren akut toxicitási próbával meghatározva kisebb, mint 3 g/kg orálisan pepszinosztreptin és annak metilésztere esetén és kisebb, mint 5 g/kg P-pepszinosztreptin és metilésztere esetében, míg intraperitoneálisan 0,5 g/kg az összes pepszinosztreptin esetén. A pepszinosztreptinek toxicitása tehát alacsony, ezek széles pH-tartományban stabilisak, hidrofilek, könnyen kristályosíthatok, hosszú időn át tartózkodnak a gyomorban és a pepszin aktivitását képesek gátolni, megelőzik a sziaÜnsav felszabadulását a gyomor nyálkahártyájából és patkányokon megelőzik vagy gyógyítják a gyomorfekélyt. így a pepszinosztreptineketgyógyszerként használhatjuk hyperpepsia, hyperpepsinia, gyomor- és nyombélfekély megelőzésére és kezelésére, ezekben az ", esetekben a pepszin okozza a megbetegedést, valamint a gyomor savtartalmának normalizálására is használhatók. A fentiek illusztrálására a pepszinosztreptinek gyomorfekélyre gyakorolt hatását mutatjuk be az alábbi 2. táblázatban olyan patkányokon, amelyekben az alsó gyomorszáj lekötésével gyomorfekélyt indukáltunk [Gastroenterology, 5, 43 (1945)]. A kapott eredmények a pepszinosztreptinek hatékonyságát bizonyítják. 3
