170211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás R- karbamilaminosavak és a megfelelő R- aminosavak előállítására

170211 3 4 hidrolízise hosszabb időt vesz igénybe, akkor a másik antipódnak is jelentős mennyisége hidrolizálódik és így olyan termékek keletkeznek, amelyek optikai szempontból nem tiszták. Fentieken túlmenően a nem kívánt antipód átalakítása racém vegyületté általában erős reakciókörülmények között megy végbe és az elméletitől nagyon eltérő hozamot eredményez. A találmány tárgya eljárás a IV általános képletű vegyületek — mely képletben R jelentése rövidszénláncú alkilcsoport, R| pedig — CONH2 csoportot vagy hidrogénetomot képvisel — egyszerű és gazdaságos módon. A találmány szerinti enzimatikus hidrolízis lehetővé teszi racém vegyületből kiindulva csak az egyik sztereoizomer aminosav vagy aminosav-származék előállítását, az enzim szigorúan szelektív, a racém vegyületben levő két módosulat közül csak egyikre gyakorolt hatása révén. Meglepő módon azt találtuk, hogy különböző enzimek hatnak a vegyületek racém módosulatainál szigorúan szelektív hidrolízissel a két módosulat közül specifikusan csak egyre. Ezeknek az enzimeknek az ismertetésére az alábbiakban fogunk rátérni. Az ilyen enzimfajták körébe tartoznak például az olyan enzimek, amelyeknek az alább ismertetett szerkezetű, aszimmetrikus szénatomot nem tartalmazó vegyületekre kifejtett hidrolizáló hatása ismert. Ugyancsak ismeretesek olyan enzimek, amelyek képesek a sztereoizomer vegyületek közül csak egyiket hidrolizálni, de az ilyen enzimeket sohasem használták racém kiinduló anyagok esetében. Az emzimeknek ezt a csoportját használják a találmány szerinti eljárás során. Másrészt a szakemberek előtt ismeretes, hogy egyszerű kísérlettel meg lehet állapítani, hogy a már ismert vagy az új enzimek alkalmazhatók-e a találmány szerinti eljárásban; ugyanis elegendő ezeknek a racém vegyületekkel szembeni viselkedését megvizsgálni. Az ismert dihidropirimidináz nevű enzim például, amelyet borjumájból nyertünk ki Donald P. Wallach és Santiago Grisolia módszere szerint (J. of Biol Chem. 266 277 (1957) hidrolizálja a 4,5-dihidrouracilt, a dihidrotimint és a hidantoint, azaz olyan vegyületeket, amelyek aszimmetrikus szénatommal nem rendelkeznek, meglepő viszont, hogy ha ezt az enzimet racém vegyületekhez (5-hidantoinhoz) adjuk, akkor csak R módosulatot hidrolizálja szigorúan szelektív módon. Hasonló viselkedést tapasztaltunk más enzimcsoportoknál is, amelyeket csak sztereoizomer vegyületek hidrolizálására vizsgáltunk, vagyis ezek az enzimek racém vegyület jelenlétében használva, általában erősítették a hidrolizáló hatást a két módosulat egyikénél, szigorúan szelektív módon. Ezért beszélünk arról, hogy az enzimek képesek szigorúan szelektív módon hidrolizálni a sztereó-módosulatok egyikét, racém vegyület jelenlétében. A találmány szerinti eljárás tehát olyan enzimekkel valósítható meg, amelyek az alábbiakban meghatározott racém vegyülettel reagálnak, illetve hidrolizálják azt, szigorúan szelektív módon, úgy, hogy a racém vegyület két módosulatának csak egyike hidrolizálódik. A fent említett dihidropirimidinázzal kapcsolatban meglepő módon azt találtuk, hogy ez az enzim, amely ismert módon használható olyan vegyületek hidrolízisénél amelyek aszimmetrikus szénatommal nem rendelkeznek, szigorúan szelektív hatást mutat csak az R-módosulatra, ha racém anyagok jelenlété-5 ben alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárás lényege, hogy az I általános képletű, 5-helyzetben helyettesített hidantoinszármazékot- ahol R jelentése rövidszénláncú alkilcsoport — a racém vegyületeknek csak az R-mó-10 dosulatára ható, aszimmetriás szénatomot nem tartalmazó hidantoinok hidrolizálására is képes enzim, célszerűen borjúmájból kivont dihidropiramidináz jelenlétében 6—11 pH érték mellett hidrolizáljuk és a) a kapott, olyan IV általános képletű R-aminosav-15 származékot melyben R jelentése a fenti, és R! —CONH2

csoportot képvisel, elválasztjuk, a maradék S-módosulatot vizes oldatban, az előző műveletnél magasabb hőmérsékleten, 7-nél magasabb, előnyösen 8-nál magasabb pH értéken racemizáljuk, a racemizált 20 vegyületet visszavezetjük a folyamatba, vagy b) a nem hidroüzált S-vegyület racemizálását elválasztás nélkül, az enzimatikus hidrolízissel együtt folytatjuk le, kívánt esetben pedig a kapott IV általános képletű 25 R-aminosav-származékot, melyben R! jelentése —CONH2

csoport, olyan IV általános képletű vegyületté hidrolizáljuk, amelyben Rí jelentése hidrogénatom. Az 5-hidantoin speciális esetében a reakció 6—11 30 pH érték között folytatható le, ha a pH alacsonyabb mint 6, vagy magasabb 1 I-nél, akkor a reakció nagyon lassú. A hidrolízis az 1. reakcióvázlat szerint megy végbe; reakció termékként a II általános képletű R-karbamil-aminosavat kapjuk (megfelel az olyan IV 35 általános képletű vegyületnek, ahol Rí = —CONH2

)Minthogy a hidrolízis során képződött R-karbamil-aminosav savas természetű, a pH-t a reakció alatt lúg adagolásával tartjuk a kiindulási értéken. Az R-karbamil-aminosav elkülönítése a nem hidrolizált 40 S-5-hidantointól különböző módszerek szerint történhet. Gyakran óvatosan, gyenge keverés mellett a sav mennyiségével egyenértékű lúgot adunk a reakcióelegyhez, lehűtjük, 0 C°-ra, így az R-karbamil-aminosav legnagyobb részben kinyerhető, míg az 5-hidan-45 tóin oldatban marad. Azt találtuk, ha az S-5-hidantomt és R-karbamilaminosavat tartalmazó víz pH-ját 7 fölé emeljük, az optikai forgatóképességet nullára csökkentjük vagy még egy kissé ellenkező előjelűvé tesszük, akkor az 50 S-5-hidantoin racemizálódik, míg az R-karbamil-aminosav változatlan marad. Az S-5-hidantoin racemizálódásának a mértéke a pH-tól és a hőmérséklettől függ, mert annál nagyobb mértékben következik be, minél magasabb a hőmér-55 séklet és minél inkább pH = 7 érték fölé állítjuk be a kémhatást. Az ily módon előállított optikailag inaktív 5-hidantoint a következő műveletekben felhasználjuk. Végül azt találtuk, hogy ha az R-karbamu-aminosa-60 vat vízben oldjuk és forrásig melegítjük, akkor az a 2. reakcióvázlat szerint elbomlik. A képződött III általános képletű aminosavat (megfelel az olyan IV általános képletű vegyületnek, ahol Rt = hidrogénatom) nagy optikai tisztaságban lehet izolálni a víz vákuum-65 ban való elpárologtatásával. 2