170211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás R- karbamilaminosavak és a megfelelő R- aminosavak előállítására

170211 5 6 A találmány szerinti eljárás jobb megértését az alábbi példák kapcsán szemléltetjük. 1. példa 1 liter 142 g 5-izopropilhidantoint tartalmazó oldat pH-ját 8-ra állítjuk be nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával és 2 l-es pH szabályozóval és keverővel ellátott edénybe öntjük. Miután megindítjuk a keverést, borjúmájból nyert 10 cm3 dihidropirimidináz-oldatot adunk hozzá. Enzim-aktivitás: 74 egység/ml (1 egység annak az enzimmennyiségnek felel meg, amely 1 jiimol hidantoint 1 perc alatt, 30 C°-on 8,0 pH érték mellett hidrolizál). Egyidejűleg a pH-t, melyet kezdetben automatikus pH-szabályozó segítségével állítottunk be, állandóan 8 körül tartjuk, 5 N nátrium-hidroxid-oldat szükség szerinti adagolásával. A reakció, amely kezdetben nagyon heves, csökken, ahogy az 5-izopropilhidantoin elhasználódik. A készüléket egy éjszakán át működtetjük; a reakció addig tart, amíg 100 cm3

nátrium-hidroxid-oldat elhasználódik. Reggel a nátrium-hidroxid-oldat adagolását leállítjuk és lassan 5 N sósavoldat adagolásával a reakcióelegyhez korábban adagolt nátriumhidroxid-oldat teljes mennyiségét semlegesítjük. Ekkor fehér kristályok kezdenek kiválni, melyek kiválását úgy segítjük elő, hogy a készüléket lehűtjük és néhány órán keresztül 0 C°-on tartjuk. Szűrés és 100 cm3

jeges vízzel való mosás segítségével 60— —70 g A jelű szilárd terméket kapunk és a B jelű mosóvizet és a kezelt C jelű anyalúgot elkülönítjük. Az A szilárd termék nedves R-karbamil-valint, nátrium-klorid-nyomokat és proteineket tartalmaz. Ezt a terméket 200 cm3

vízben szuszpendáljuk, gőzzel forrásig melegítjük és ekvimolekuláris mennyiségű 10%-os HCl-oldatot adunk hozzá. A termék oldódik és szén-dioxid fejlődik. Az oldatot vákuumban bepároljuk, maradékként R-valint és ammónium-kloridot kapunk, amelyből az R-valint ismert tnódon, például ioncserélő gyanta segítségével választjuk el. A termék optikai forgatóképessége [a]p = -28,3 (c = 8,6 N HCl), olvadáspontja 310-315 C° (zár kapillárisban). Az anyalúg további kezelésével lehetővé válik még kis mennyiségű termék kinyerése. A B mosóvizet az újabb műveletben közvetlenül fel lehet használni. A C anyalúgnak kb. 2,5 pH-ja és jelentős optikai forgatóképessége van, ([a]D

= —134, c = etanol), mert S-izopropilhidantoint tartalmaz. Amikor a pH-t 8,5-9-re visszük fel és az oldatot 24—36 órán át 35—40 C°-on tartjuk, akkor elveszti optikai forgatóképességét, mert az 5-izopropilhidantoin racemizálódik. Ezután a pH-t 7-re állítjuk be sósav hozzáadásával és az oldatot vákuumban szárazra pároljuk. Hozam: 70%, valin móka számolva. A szilárd maradékot ismét 60 C°-on vízzel kezeljük és szűrjük. Az oldat nátrium-klorid mellett kb. 70 g 5-izopropilhidantoint és 10-^20 g R-karbamilvalint tartalmaz, nátriumsó formájában. Ezt az oldatot 72 g 5-izopropilhidantoin hozzáadása után az újabb műveletekhez használhatjuk. A találmány szerinti eljárás gazdaságosabb, ha oldhatatlanná alakított enzimet használunk. Az enzim oldhatatlanná tételére a technikában szokásos módszereket (pl: Zaborsky, 0.: „Immobilized Enzymes", Chemical Rubber Co., Press, Clevebant, Ohio, 1973.) alkalmazhatjuk, pl. az enzimet kémiai úton hordozóhoz kötjük vagy az enzimet szálas szerkezetbe ágyazzuk. Ez a körülmény lehetővé teszi, hogy olyan oldattal dolgozzunk amely nem tartalmaz proteineket és a termék könnyen elválasztható, tisztítható és az át 5 nem alakult 5-hidantoin könnyebben recirkuláltatható. 2. példa 1 liter oldatot készítünk, amely a következő 10 anyagokat tartalmazza: a) 500 cm3

anyalúgot, amelyet az előző műveletben kaptunk, b) 57 g szintetikus 5-metilhidantoint; c) desztillált vizet és nátrium-hidroxid-oldatot 15 olyan mennyiségben, hogy 1 liter pH = 8,5 oldat keletkezzen. Kis méretű üvegcsőbe 60 cm3

dihidropirimidináz oldatot ágyazunk be a 836 462 sz. olasz szabadalmi leírásban leírt módszer szerint. Az oldatot 35 C°-on 20 tartva az edényből egy szivattyú segítségével a csőben levő szálakra juttatjuk, majd azokon átfolyatva ismét az edénybe visszavezetjük. Az edény keverővel és pH szabályozóval van ellátva, amely a pH-t 8,5 értéken tartja 5 N nátrium-hidroxid-oldat segítségével. A 25 nátrium-hidroxid-oldat fogyasztását csökkentjük, ahogy a reakció előrehalad és gyakorlatilag leállítjuk, ha a teljes fogyasztás meghaladja a 100 cm3

-t. Az oldatot az edényben visszanyerjük, gyengén keverjük és a felhasznált nátrium-hidroxid-oldatnak 30 megfelelő mennyiségű 5 N sósavoldatot adunk hozzá. Az edényt néhány órán át 0 C°-on tartjuk, azután a kikristályosodott A jelű R-karbamil-alanint leszűrjük és 100 cm3

jeges vízzel többször mossuk. Súlya: 60 g. 35 AB jelű mosóvizet és a C jelű anyalúgot visszanyerjük és félretesszük. Az R-karbamil-alanint 200 cm3

vízben oldjuk, az oldatot forrásig melegítjük mialatt lassan ekvimolekuláris mennyiségű 10%-os HCl-t adunk hozzá és azután vákuumban szárazra 40 pároljuk. Ily módon egy R-alaninból és ammóniumkloridból álló maradékot kapunk, melyből az R-alanin szokásos módszerek segítségével, például ioncserélő gyanta segítségével elkülöníthető. Hozam: 80%, alanin mól-ra számolva. 45 AC jelű anyalúg pH-ját 8,5-re állítjuk, azután 30—35 C -on tartjuk 48 órán át, így gyakorlatilag nem lesz optikai forgatóképessége. Ezután a pH-t sósavval 7-re csökkentjük és vákuumban 100 cm3-re besűrítjük, így a nátrium-kloridot eltávolítjuk. Kb. 50 60 C°-on leszűrjük és a kivált csapadékot 10-20 cm3 60 C°-ra melegített telített' nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szűrőn levő maradék gyakorlatilag tiszta nátrium-klorid. A leszűrt terméket és a mosó oldatot a B 55 jelű mosóvízzel egyesítjük, desztillált vízzel 500 cm3

-re egészítjük ki és a következő műveletben használjuk. Az oldhatatlan enzimek használata egy műveletben teszi lehetővé az 5-hidantoin majdnem teljes átalakítását R-karbamil-aminosavvá, mert azS-5-hidantoin race-60 mizálódik, ahogyan az R-5-hidantoin elhasználódik. 3. példa 556 g szintetikus 5-metilhidantoint vízben oldunk, azután vizet és nátrium-hidroxid-oldatot adunk hoz•65 zá, így 2 1 8,5 pH értékű oldatot kapunk. Az 1. ábra 3