170194. lajstromszámú szabadalom • Kompozíció és eljárás koleszterin összmennyiségének meghatározására

170194 13 14 A Whatman Biochemicals Ltd. (Maidstone, Kent, Nagy-Britannia) cég által DE-52 márkanéven forgalomba hozott dietilaminoetil-cellulózt 0,05 mólos, 0,28% taurokólsav-nátriumsót és 0,01% nátriumazidot tartalmazó kálium-foszfát-puff erben (pH-érté- 5 ke 6,6) mossuk, majd szuszpenzió formájában 5 cm x 90 cm méretű oszlopba töltjük 200 ml mosó puffer segítségével (a puffer a töltet tetején marad) úgy, hogy egy literes töltettérfogat alakuljon ki. A fentiekben ismertetett módon előállított puffer-extraktum- 10 ból ezután 4 liternyi mennyiséget az oszlopra felviszünk, majd először 50 ml 0,05 mólos, 0,28% taurokólsav-nátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel (pH-értéke 6,6) eluálunk, ahol a puffer ugyanakkor merkapto-etanolt is tartalmaz olyan mennyiségben, hogy arra nézve 0,01 mólos. Az oszlopot ezután kálium-foszfátra nézve 0,2 mólos, míg merkapto-etanolra nézve 0,01 mólos, 0,28% taurokólsav-nátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó pufferrel (pH-értéke 6,6) eluáljuk folyamatosan. Az oszlopból távozó eluátumot 22 ml-es frakcióban gyűjtjük, majd a frakciók enzimaktivijását a példa b) részében ismertetett módon, míg fehérjetartalmát a fentiekben említett módon mérjük. A kapott eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg, illetve grafikusan ábrázoljuk a_csatolt 2/1 rajzlapon látható ábrán. Térfogat (ml) Fehérje (mg) Enzimaktivitás (egységek) Fajlagos aktivitás [egység/mg] Hoza (%) pankreatinszuszpenzió 105 10 000 3150 0,3 100 puffer-extraktum 91 5 960 1840 0,3 58 dietilaminetilcellulóz utáni eluátum 103 260 850 3,3 27 Látható a táblázatból, hogy minden egyes művelet után csökken a proteolitikus aktivitás. A 2/1 ábrán a dietilaminoetil-cellulóz oszlopon a kétféle eluálószerrel végzett eluálást grafikusan is ábrázoljuk. Az eluálás során — miként említettük — 22 ml-es frakciókat gyűjtünk, és összesen 300 frakció képződik. Az ábra vízszintes tengelyén ábrázoltuk tehát, hogy az eluátum 300 frakcióból áll. A fekete pontokat összekötő, összefüggő vonal az egyes frakciók fehérjetartalmát, míg a szaggatott vonal a koleszterinészter-hidroláz aktivitását mutatja. Látható, hogy az első kétszáz frakcióban a koleszterinészter-hidroláz aktivitása nulla. Jelezzük továbbá az ábrán, hogy — miként már említettük — először 0,05 mólos káliumfoszfát pufferrel, majd 0,2 mólos kálium-foszfát pufferrel eluálunk. Az első pufferböl általában 50-250 ml-nyi mennyiségre, míg a második pufferböl közel 2 literre van szükség. Az ábra jelzi, hogy a fehérje döntő része eluálódik az oszlopból azt megelőzően, hogy a koleszterinészter-hidroláz eluálódna. A dietilaminoetil-cellulóz utáni eluátum koleszterinészter-hidrolázt tartalmazó frakciót ezután egyesítjük, majd mintegy 100 ml térfogatra betöményítjük Diaflo UM—10 márkanevű ultraszűrő-membránt (gyártó cége az Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazva. A kapott koncentrátumot ezután kálium-foszfátra nézve 0,05 mólos, 0,28% taurokóolsav-nátriumsót ,és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó puffer (pH-értéke 7>,6) százszoros térfogat mennyiségével szemben 4 °C-on egy éjszakán át dializáljuk a puffert egyszer cserélve. A kálium-foszfátra nézve 0,2 mólos és merkaptoetanolra nézve 0,01 mólos, 0,28% taurokólsav-nátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó pufferrel mint eluálószerrel kapott frakciók nem tartalmaznak 30 sem tripszint, sem kimotripszint, így proteolitikus aktivitást nem mutatnak. A példa további részében a koleszterinészter-hidroláz aktivitásának meghatározásához használt koleszteril-oleát szubsztrátum előállítását, valamint az emlí-35 tett enzim aktivitásának meghatározását ismertetjük. a) Szubsztrátum előállítása Teflonból készült merülő dugattyúval felszerelt homogenizáló csőben 1 ml etiléterben feloldunk 10 mg koleszteril-oleátot és 18 mg DL—lecitint. A kapott 40 oldathoz ezután 6 ml 0,1 mólos, 0,28% taurokólsavnátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-puffert (pH-értéke 6,6) adunk, majd a keveréket a dugattyú 5 perces mozgatása útján homogenizáljuk. Az étert ezután eltávolítjuk úgy, 45 hogy a csövet forró, áramló víz felett tartjuk 15 percen át, miközben a dugattyút időnként megmozgatjuk. Az oldatot ezután jeges fürdőben lehűtjük, majd 15 percen át tartó ultrahangos kezelésnek vetjük alá Sonifier W140 típusú, sejtroncsoló berendezését és 50 Sonifier L tápegységet [mindkét berendezés gyártója a Branson Sonic Power Company plainviewi (New-York állam, Amerikai Egyesült Államok) cég] használva. Az oldatot ezután 15 percen át 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, és az elkülö-55 nített oldhatatlan anyagokat eldobjuk. b) Enzimaktivitás kiértékelése A fentiekben ismertetett módon előállított szubsztrátum előzetesen 37 °C-ra melegített 1 ml-nyi mennyiségéhez 25 ßl enzimoldatot adunk, majd a 60 kapott keveréket 37 °C-on 10 percen át inkubáljuk. Az elegyhez ezután 4 ml Bloor-féle oldószert (75% etanol és 25% etiléter elegye) adunk, majd az így kapott oldatot 2000 fordulat/perc sebességgel 10 percen át centrifugáljuk. A kapott felülúszó folyadék-65 fázisból 1 ml-t elegyítünk 1 ml 1,0%-os digitonin-7