170194. lajstromszámú szabadalom • Kompozíció és eljárás koleszterin összmennyiségének meghatározására

170194 15 16 oldattal (oldószer 50% etanol és 50% víz elegye). Az elegyet ezután 12 órán át állni hagyjuk, amikor is csapadék válik ki, vagyis a digitanin kicsapja a szabad koleszterint. A csapadékos elegyet 2500 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, majd az így 5 elkülönített csapadékot 4 ml acetonnal mossuk és ismételten centrifugáljuk. A csapadékot ezután szobahőmérsékleten enyhe légáramban szárítjuk, majd 3 ml, jégecettel készült 0,1%-os vas(III)-klorid-hexahidrát-oldatot adunk hozzá feloldásra. A kapott oldathoz 10 2 ml tömény kénsavat adunk, amikor is lassan két fázis alakul ki. A két fázist gyorsan összekeverjük és a keverék optikai sűrűségét 560 nm-en mérjük. Az így kapott értéket ezután elosztjuk egy, ismert mennyiségű szabad koleszterint tartalmazó minta azonos módon 15 mért optikai sűrűség-értékével. Annak érdekében, hogy az eredményeket aktivitásegység/ml értékekben adhassuk meg, a kapott hányadost idő- és hígításfaktorokkal szorozzuk, amikor is az eredményt jumól koleszterin/ml-óra egységben kapjuk. Közelebbről, 20 0,1 jitmól szabad koleszterinnel végezzük a fenti mérést el 2,5 ml felülúszó folyadékfázist használva, amikor is a kapott optikai sűrűség 1,248. Minthogy a mérési idő 10 perc és alkalmazott térfogat 25 jul, az időfaktor értéke 6, míg a hígítási faktoré 40. Így a 25 koleszterinészter-hidroláz aktivitása az alábbi képlet alapján számítható: aktivitásegység/ml: OD5 1,248 240 30 ml-nyi mennyiséggel 20 percen át 37 °C-on inkubálunk, majd a kapott elegy 450 nm-en mutatott abszorpcióját mérjük 1 cm fényútú küvettát használva. A kapott eredményeket a csatolt 2/2 rajzlapon látható ábrán ábrázoljuk. 4. példa Az 1. példában ismertetett minőségű koleszterinészter-hidroláz oldatból 1,0 ml, koleszterin-oxidáz oldatból 1,0 ml, peroxidáz-oldatból 0,8 ml és o-dianizidin oldatból 0,2 ml elegyébe abszorbens szűrőpapírból egy ívet bemártunk. A bemártást követően a szűrőpapírt megszárítjuk, majd 5 mm x 5 mm méretű csíkokra vágjuk, a csíkok mindegyikét pedig kétoldalt ragadó ragasztószalaggal átlátszó műanyagból készült azonos méretű csíkokhoz ragasztjuk. Az így kapott indikátoreszköz színe megváltozik, ha olyan mintába mártjuk be, amelyben a koleszterin összmennyiségét meg akarjuk határozni. Az indikátoreszköz színváltozásának intenzitását úgy fokozhatjuk, ha a bemáitás után megszárított szűrőpapírt újra a kiindulási elegybe mártjuk, majd a szűrőpapírt megszárítjuk. Ez az impregnálásos kezelés annyiszor ismételhető, míg kielégítő színváltozást kapunk, ha az indikátoreszközt koleszterint tartalmazó mintába mártjuk. A színváltozás műszeresen vagy — ha eléggé intenzív — vizuálisan észlelhető. Szabadalmi igénypontok 3. példa Az összes koleszterintartalom meghatározására alkalmas kísérleti kompozíciót készítünk el az alábbi komponensekből (a komponensek mennyiségét 1 liter térfogatra adjuk meg): koleszterinészter-hidroláz 67 egység koleszterin-oxidáz 83 egység peroxidáz 33 000 egység o-dianizidin-dihidroklorid 0,41 millimól taurokólsav-nátriumsó 5,2 millimól Triton X-1001 /felületaktív anyag 0,5 ml nátrium-azid 2,0 millimól kálium-foszfát puffer (pH 6,6) 0,5 mól 1. izooktil-fenoxipolietoxi-etanol, gyártja a Rohm and Haas Company (Philadelphia, Pennsylvania állam, Amerikai Egyesült Államok) cég. Zak és munkatársai vizsgálati módszere [Amer. J. Clin. Pathol., 24, 1307 (1954)] szerint különböző koncentrációkban koleszterint (összesen koleszterintartalomra nézve) tartalmazó, az 1. példában említett Serachol márkanevű kontrollszérumból különböző mintákat az alábbi módon vizsgálunk: a kísérleti mintából 15 jul-nyi térfogatú mennyiséget a fentiekben említett összetételű kísérleti kompozícióból 3,0 1. Kompozíció koleszterin összmennnyiségének meghatározására biológiai folyadékmintákban, előnyösen vérszérumban, amely kompozíció koleszterin-35 oxidázt, adott esetben a folyadékmintával alkotott elegy pH-értékét 5 és 8 között tartó pufferoló anyagot, adott esetben valamilyen baktérium-növekedését gátló anyagot, továbbá hidrogén-peroxid meghatározására peroxidázt és valamilyen redox-indiká-40 tort tartalmaz, azzal jellemezve, hogy kokszterinészter-liidrolázt és adott esetben a koleszterinészterhidrolázzal együttható epeeredetű faktort, előnyösen kólsavat, glikokőlsavat, taurokólsavat vagy taurodezoxikólsavat vagy ezek valamelyik sóját tartalmazza. 45 2. Indikátoreszköz koleszterin ősszmennyiségének meghatározására biológiai folyadékmintákban, előnyösen vérszérumban, azzal jellemezve, hogy abszorbens hordozóanyagból, előnyösen nedvszívó papírból, polimer alapú szövetből vagy pórusos műanyagból és 50 az 1. igénypont szerinti kompozícióból álL 3. Eljárás koleszterin ősszmennyiségének meghatározására biológiai folyadékmintákban, előnyösen vérszérumban, azzal jellemezve, hogy a biológiai folyadékmintát az 1. igénypont szerinti kompozícióval 55 vagy a 2. igénypont szerinti indikátoreszközzel érintkeztetjük, majd a képződött hidrogén-peroxidot kolorimetriásan meghatározzuk. 2 rajz A kiadásért felelős a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 77-2298 - Dabasi Nyomda, Budapest - Dabas Felelős vezető: Földes Gyöigy igazgató