170194. lajstromszámú szabadalom • Kompozíció és eljárás koleszterin összmennyiségének meghatározására

170194 11 12 0,1 mólos kálium-foszfát-puffer (pH 7,0), tartalmaz még 0,01% nátrium-azidot; peroxidázoldat (a peroxidázt a Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey állam, amerikai egyesült államokbeli cég szállítja) - 0,1 mg fehérje/ml 0,1 mólos kálium-foszfát-puffer (pH 7,0), tartalmaz még 0,01% nátriumazidot; o-dianizidin - 1 mg/ml 90%-os etilénglikolmonometiléter; puffer - 0,1 mólos kálium-foszfátpuffer (pH 6,6), amely 0,28% taurokólsav-nátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmaz; és vérszérum — Serachol1

márkanevű, szabványosított és 1 560 031 számmal forgalomba hozott vérszérum. Ezeket a reagenseket az alábbi mennyisegekben elegyítjük: Koleszterin összmennyiségére vizsgált minták (ml) Szabad koleszterin mennyiségére vizsgált minták (ml) vakpróba tényleges minta vakpróba tényleges mir koleszterinészterhidroláz 1,0 1,0 -koleszterin-oxidáz 1,0 1,0 1,0 1,0 peroxidáz 0,8 0,8 0,8 0,8 o-dianizidin 0,2 0,2 0,2 0,2 puffer --1,0 1,0 szérum1 _ 0,05 — 0,05 1. a vérszérumként alkalmazott Serachol márkanevű készítmény 100 ml-ként összesen 346 mg koleszterint 30 és ezen belül 74 mg szabad koleszterint tartalmaz; gyártó cége a Warner-Chilcott Laboratories morris plains-i (New Jersey állam, Amerikai Egyesült Államok) cég. A négyféle oldatot 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, 35 majd az egy óra elteltével 450 mm-nél mérjük az optikai sűrűség megfelelő értékeit. Az alábbi eredményeket kapjuk: 40 45 Optikai sűrűség 450 nm-en koleszterin összmennyiségére vizsgált vakminta 0,245 koleszterin összmennyiségére vizsgált tényleges minta 0,845 szabad koleszterin mennyiségére vizsgált vakminta 0,140 szabad koleszterin mennyiségére vizsgált tényleges minta 0,280 50 55 A fenti eredmények vizsgálatának tanúsága szerint ha mind a koleszterin összmennyiségére, mind a szabad koleszterin mennyiségére vizsgált tényleges minták optikai sűrűségének értékeiből levonjuk a 60 vakminták optikai sűrűségének értékeit, akkor a koleszterin összmennyisége és a szabad koleszterin között arány 0,233. Ez valóban megközelíti a szabványosított szérumból ismert, 0,214 nagyságú arányértékét. 65 2. példa Ebben a példában bemutatjuk, hogyan állítunk elő koleszterinészter-hidrolázt tartalmazó, proteolitikus aktivitástól lényegében mentes extraktumot. 10 g kereskedelmi minőségű, 4XNF jelzésű Pankreatin (előállítását lásd az American Pharmaceutical Association, Washington, District of Columbia, amerikai egyesült államokbeli szervezet által 1970-ben kiadott National Formulary XIII elnevezésű kiadványban) 100 ml 0,05 mólos, 0,28% taurokólsavnátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel (pH-értéke 6,6) készült oldatát szobahőmérsékleten körülbelül 30 percen át keverjük. A pankreatin így kapott szuszpenziójából 1 ml-t összekeverünk 2 ml 0,05 mólos, 0,28% taurokólsavnátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó kálium-foszfát pufferrel (pH-értéke 6,6), majd a kapott keverék enzimaktivitását a példa későbbiekben ismertetett b) részében említett módon mérjük. A szuszpenzió megmaradt részét négy, egyenlő térfogatú részre osztjuk, majd külön-külön 30 percen át 15 000 fordulat/perc sebességgel 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszó fázisokat egyesítjük, és az így kapott pufferextraktum 0,1 ml-jét 9,9 ml 0,1 mólos 0,28% taurokólsav-nátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel (pH-értéke 6,6) elegyítjük. Az így hígított extraktum fehérjetartalmát ezután a Methods in Enzimology (III. kötet, 451-454. oldal, megjelent 1957-ben New-York-ban Colowick és Kaplan szerkesztésével az Academic Press kiadó gondozásában) irodalmi helyen ismertetett módon meghatározzuk. Ugyanakkor a puffer-extraktum 0,1 ml-jét elegyítjük 0,2 ml 0,1 mólos, 0,28% taurokólsav-nátriumsót és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel, majd az így kapott elegy enzimaktivitását a példa b) részében ismertetett módon mérjük. 6