170194. lajstromszámú szabadalom • Kompozíció és eljárás koleszterin összmennyiségének meghatározására

170194 9 10 1. Referenciapélda A Whatman Biochemicals Ltd. (Maidstone, Kent, Ebben a példában azt kívánjuk bemutatni, hogyan Nagy-Britannia) cég által forgalmazott, koleszterinképződik hidrogén-peroxid, ha a vizsgálni kívánt, oxidázt tartalmazó sejtmentes extraktum felhasználászabad koleszterint tartalmazó folyadékmintát és az sával háromféle, az alábbi komponenseket tartalmazó alábbiakban ismertetett összetételű, csak szabad ko- 5 oldatot készítünk: leszterin mérésére alkalmas vizsgálati kompozíciót érintkeztetjük. Forralt, Kontrolloldat koleszterinoxidáz(ml) extraktumot tartalmazó vakpróba (ml) 0,2 0,2 0,8 Koleszterin-oxidázt és koleszterint tartalmazó oldat (ml) 1 mólos kálium-foszfátpuffer (pH 7,5) 0,2 Koleszterin-oxidázt tartalmazó extraktum (0,13 aktivitásegység) (ml) 0,8 Koleszterin-oxidázt tartalmazó, 15 percen át forralt extraktum -aceton -koleszterin 1%-os acetonos oldata 0,1 peroxidáz/o-dianizidin 1,0 0,8 0,1 0,1 1,0 1,0 A továbbiakban a koleszterin-oxidáz enzim egy mázó acetonos törzsoldatokat készítünk. 0,13 aktiviaktivitásegységét úgy definiáljuk, hogy egy aktivitás- 35 tásegység/ml aktivitású, koleszterin-oxidázt tartalegységen azt a mennyiségű enzimet értjük, amely egy mázó enzimoldatból 0,5 ml-t, valamint 1 mg peróra alatt képes egy mikromól koleszterin oxidációját oxidáz/1 ml koncentrációban peroxidázt tartalmazó egy mikromól A -kolesztén-3-onná és egy mikromól és o-dianizídin-dihidrokloriddal telített peroxidáz/ohidrogén-peroxiddá katalizálni. (Ugyanígy a későbbi- dianizidin-oldatból 0,5 ml-t adunk a fenti törzsoldaekben alkalmazott koleszterinészter-hidroláz enzim 40 tok 0,05-0,05 ml-jéhez, valamint a pusztán acetonaktivitását'úgy definiáljuk, hogy^egy aktivitásegység- ból álló, 0,05 nil térfogatú kontrolloldathoz. A nyi az enzimnek az a mennyisége, amely képes egy háromféle oldatot oxigéngázzal átfúvatjuk, majd 37 óra alatt egy mikromól koleszteril-oleát hidrolízisét °C-on egy órán át inkubáljuk, és az üikubálás után katalizálni. (A peroxidáz)-o-dianizidin-oldat ml-ként 1 minden egyes oldathoz 1 ml 65%-os kénsavoldatot mg peroxidázt tartalmaz és o-dianizidin-dihidroklorid- 45 adunk. Ezután 540 mm-en mérjük az optikai sűrűsédal telített. A fenti három oldatot 37 °C-on inkubál- geket, amikor is az alábbi eredményeket kapjuk: juk egy órán át, miután molekuláris állapotú oxigénnel, vagyis oxigéngázzal átfúvattuk az oldatokat. Az Optikai sűrűség 540 nm-en inkubálás után minden egyes oldathoz 1 ml 65%-os kénsavoldatot adunk, majd az oldatokat szűrjük és 50 Kontrolloldat 0,07 540 nm-nél abszorpciójukat meghatározzuk. A kont- 0,5 mg koleszterin/100 ml 0,12 rolloldat optikai sűrűsége 0,080, míg a forralt enzim- 1,0 mg koleszterin/100 ml 0,21 extraktumot tartalmazó vakpróbáé 0,020. A koleszterin-oxidázt és koleszterint tartalmazó oldat optikai 1. példa sűrűsége 0,540, igazolva a hidrogén-peroxidnak az 55 Ebben a példában a koleszterin összmennyiségének o-dianizidin oxidációja útján jelzett képződését. meghatározására szolgáló vizsgálati kompozíciót és módszert ismertetünk. 2. Referenciapélda Elkészítjük az alábbi reagenseket: Ebben a referenciapéldában azt mutatjuk be, hogy koleszterinészter-hidroláz (szállítja a Miles Laboraa szabad koleszterin növekvő mennyisége fokozódó 60 tories, Elkhart, Indiana állam, USA-beli cég) — 32 kolorimetriás változást eredményez a szabad kolesz- aktivitásegység/ml, 9,4 mg fehérje/ml 0,1 mólos térin meghatározására az 1. referenciapéldában emlí- kálium-foszfát-puffer (pH 6,6), tartalmaz még 0,28% tett előnyös módszert (vagyis a hidrogén-peroxid taurokólsav-nátriumsót és0,01%nátrium-azidot; mérésén alapuló módszert) alkalmazva. koleszterin-oxidáz (a referenciapéldában említett mi-0,5 mg/ml és 0,1 mg/ml szabad koleszterint tártai- 65 nőségű) — 4 aktivitásegység/ml, 16 mg fehérje/ml 5