170194. lajstromszámú szabadalom • Kompozíció és eljárás koleszterin összmennyiségének meghatározására

170194 7 * vizsgálati kompozíció lényegében mentes legyen proteolitikus aktivitástól, azaz ne tartalmazzon olyan anyagokat, amelyek képesek a fehérjék lebomlását elősegíteni. Ha a vizsgálati kompozíció proteolitikus aktivitású, akkor a fehérjék lebomlanak, miáltal természetszerűleg katalitikus aktivitásukat elvesztik. A koleszterinészter-hidroláz enzim hatását elősegítő anyagok ugyanakkor jellegükből eredő képességüknél fogva megvédik ezt az enzimet a proteolitikus lebomlástól azon kívül, hogy az enzimet tartalmazó kémiai rendszer katalitikus aktivitását fokozzák. A koleszterin-oxidáz és a peroxidáz azonban ilyen módon nem védhető, vagyis, ha a vizsgálati kompozíció tartalmazza ezeket az anyagokat, a vizsgálati kompozíciónak nem lehet proteolitikus aktivitása. így az extrakció útján kapott koleszterinészter-hidroláz kombinálása olyan fehérjékkel, mint a koleszterin-oxidáz és a peroxidáz, megköveteli egy új módszer kidolgozását olyan, koleszterinészter-hidrolázt tartalmazó extraktum előállítására, amely lényegében mentes proteolitikus aktivitástól. Ezért úgy járunk el, hogy egy, koleszterinészterhidrolázt tartalmazó anyagot és egy, adott esetben valamilyen szervetlen sót oldatban tartalmazó első vizes fázist elegyítünk, a kapott folyékony és szilárd fázisokat egymástól elkülönítjük, az így elkülönített folyadékfázist olyan adszorbenssel töltött oszlopon bocsátjuk keresztül, amely adszorpcióra képes dietilamino-etil-csoportokat tartalmaz, ezután az oszlopon olyan szervetlen sóoldatból álló második vizes folyadékot bocsátunk keresztül, amely szervetlen söoldat képes az oszlopból a koleszterinészter-hidrolázt eluálni. Azt találtuk ugyanis, hogy egy megfelelően megválasztott szervetlen sókoncentráció esetében a koleszterinészter-hidroláznak nagyobb az affinitása dietilamino-etilcsoportokat tartalmazó adszorbensekhez, mint a proteolitikus hatású anyagoké. Előnyös adszorbensnek találtuk a dietilamino-etilcellulózt, bár a dietilamino-etilcsoport kapcsolódhat más, a cellulóztól eltérő minőségű váz- vagy hordozóanyaghoz is. A "dietilamino-etilcsoportokat hordozható anyagok közül megemlíthetjük például a cellulóz különböző származékait. Az első vizes fázis — mint említettük — adott esetben tartalmazhat oldatba vitt szervetlen sót. Mind az első, mind a második vizes fázis előnyösen tartalmaz valamilyen pufferoló hatású anyagot annak érdekében, hogy a koleszterinészter-hidroláz katalitikus aktivitására nem hátrányos pH tartomány tartható lehessen, A puffer pH-értéke előnyösen mintegy 5 és mintegy 8 közötti, optimálisan 6,6. Előnyös továbbá, ha az adott esetben alkalmazott szervetlen só maga pufferoló hatású. Közelebbről előnyösen használható első és második vizes fázisok a káliumfoszfát oldatai. Az első vizes fázisban a kálium-foszfát koncentrációja legfeljebb 0,05 mól, míg a második vizes fázisban 0,15 mól és 1,0 mól közötti. A kálium-foszfát említett koncentrációjú oldataival azonos ionerősségű szervetlen sóoldatok is alkalmazhatók alternatív módon első és második vizes fázisként. Pufferoló hatású szervetlen sókként megemlíthetjük az acetátokat, citrátokat, tartarátokat és a ftalátokat. A fentiekben említett módszert részletesen a 2. példában ismertetjük. Előnyös továbbá, ha mind az első, mind a második vizes fázis tartalmaz olyan anyagot, amely megvédi a koleszterinészter-hidrolázt a proteolitikus hatású anyagoktól. Ilyen anyagok a kólsav, glikokólsav, taurokólsav, taurodezoxikólsav, valamint ezek sói. 5 A zavaró bakteriális növekedés meggátlására az első és a második vizes fázis tartalmazhat adott esetben valamilyen bakteriális inhibitort, vagyis a baktériumok növekedését gátló anyagot is. Előnyösen alkalmazható anyag e célra a nátrium-azid. 10 A fentiekben ismertetett vizsgálati kompozíciókkal és módszerekkel vizsgálható folyadékminták közül előnyösen a vizes oldatokat említjük abban az esetben, ha a hidrogénperoxid meghatározására a korábban említett, előnyösen alkalmazható reagenskom-15 pozíciót használjuk. Meghatározható folyadékminták közül megemlíthetjük a testnedveket, így például a vérszérumot, a vizeletet és a vérplazmát, valamint más, szabad és észterkötésbe vitt koleszterint tartalmazó oldatokat, így például laboratóriumokban vagy '20 üzemekben előállított oldatokat. •<.. A vizsgálati kompozíció lehefoldat, például vizes oldat formájában, vagy pedig megszárított vagy liofilizált por alakjában. További lehetőség, hogy a megszárított vizsgálati kompozíciót valamilyen hordozó-25 anyagra felvisszük. Alkalmas hordozóanyagok e célra az olyan anyagok, amelyek képesek a vizsgálni kívánt folyadékmintát abszorbeálni. Ilyen anyag például az itatóspapír, a gyapot, valamint a polimerekből készült átitatható anyagok és a pórusos műanyagok. A 30 hordozóanyagba a megszárított vizsgálati kompozíció impregnálható, vagy továbbá a hordozóanyag a vizsgálati kompozícióval bevonható. További lehetőség a hordozóanyaghoz a vizsgálati kompozíció kémiai kötése, vagy továbbá a hordozóanyaghoz a vizsgálati 35 kompozíció fizikai kapcsolása, vagy az előbb említett módszerek bármiféle kombinációja. A hordozóanyag. ugyanakkor rögzítve lehet, vagy bármilyen más formában kapcsolódhat egy tartóeszközhöz vagy anyaghoz, amire felvihető. 40Í A találmány szerinti eljárás és kompozíció alkalmazásával a koleszterin összmennyiségének meghatározására olyan módszerhez jutunk, amely a technika állása szerint ismert módszerekhez képest egyszerűbb 45 és gyorsabb. A találmány szerinti módszer tehát kiválóan alkalmas klinikai alkalmazásra olyan személyzet által is, amely minimális szakmai képzettséggel rendelkezik. A módszer további előnye abban áll, hogy az orvosok által egyre gyakrabban kért kolesz-50 terin-meghatározások számának lényeges emelését teszi lehetővé. Meglepőnek kell továbbá tekinteni, hogy bár például a koleszterin összmennyiségének meghatározására szolgáló vizsgálati kompozíció rendkívül komplex, a kiértékelés igen egyszerű. Az említett 55 kompozíció egy előnyös változatában például koleszterin-oxidáz, koleszterinészter-hidroláz és a peroxidáz enzimeket, a koleszterinészter-hidroláz hatását elősegítő valamyen anyagot és valamilyen redoxiindflcátort tartalmaz, mégis kvantitatív eredmények elérésére 60 nincs szükség bonyolult mérési körülmények kidolgozására és a kapott mérési eredmények megbízhatóságának többszörös ellenőrzésére. A találmányt közelebbről az alábbi referencia-65 példákkal és példákkal kívánjuk megvilágítani. 4