170194. lajstromszámú szabadalom • Kompozíció és eljárás koleszterin összmennyiségének meghatározására
170194 5 6 Nyilvánvaló az első egyenletből, hogy a szabad koleszterin úgy is meghatározható, hogy a képződött A4 -kolesztén-3-ont határozzuk meg. Felismertük tehát, hogy ha a fenti rendszert koleszterinészter-hidroláz enzimmel és adott esetben az enzimmel együttható faktorként valamilyen, az epéből származó anyaggal együtt használjuk, akkor a koleszterin összmennyiségének meghatározására alkalmas kompozícióhoz jutunk. A koleszterinészter-hidroláz az alábbi reakciómechanizmus szerint katalizál: . . _. , koleszterinészter-hidroláz kolesztennészterek —.— —- — —^szabad koleszterin +,zsírsavak A koleszterin-oxidáz enzim mikroorganizmusok extrahálása útján kapható. Az e célra alkalmas mikroorganizmusok közül megemlíthetjük a Mycobacterium genust, például a Mycobacterium rubrumot, a Nocardia genusba tartozó különböző baktériumokat, például a Nocardia erythropolist, valamint a Streptomyces genusba tartozó különböző mikroorganizmusokat. A koleszterin-oxidáz egyébként kereskedelmi forgalomban beszerezhető. A koleszterin-oxidáz enzim tehát például a nem deponált Mycobacterium rubrum mikroorganizmusnak a Methods in Enzymology (1. kötet, 678—681 oldal, szerkesztői Colowick és Kaplan, kiadója a New-york-i Academic Press, 1955) irodalmi helyen ismertetett módszerrel végzett extrahálása útján kapható. E módszert röviden az alábbiakban foglalhatjuk össze. A Mycobacterium rubrum nedves sejtjeit elroncsoljuk valamilyen ismert módszenei, például homokkal végzett szétdörzsölés útján. Az eldörzsölt anyagot valamilyen pufferban, például foszfátpufferban szuszpendáljuk, majd a kapott szuszpenziót centrifugáljuk az oldhatatlan anyagok eltávolítására. Az oldható fehérjéket - amelyek egy része a koleszterin-oxidáz — tartalmazó puffert ezután például dializáljuk, hogy a zavaró alacsony molekulasúlyú vegyületeket eltávolítsuk. A koleszterinészter-hidroláz enzimet úgy kapjuk, hogy. valamilyen, a természetben előforduló anyagot, például állati vagy emberi hasnyálmirigyet, májat vagy beleket extrahálunk. Közelebbről kereskedelmi forgalomban kapható pankreatint használunk: azonban a Pankreatin nagy proteolitikus aktivitása következtében a pankreatint tisztításnak vetjük alá a későbbiekben még részletesebben ismertetett módon. A találmány értelmében tehát a hidrogén-peroxid meghatározására olyan reagenskompozíciót alkalmazunk, amely peroxidáz enzimet és indikátoranyagot is tartalmaz, az indikátoranyag hidrogén-peroxid és peroxidáz jelenlétében oxidálódik és így kolometriás elváltozást (választ) vagy színváltozást hoz létre. Peroxidáz enzimként használhatjuk a természetben előforduló peroxidázokat, így például a torma- vagy a burgonyaperoxidázt. A fentiekben említett indikátoranyagok olyan oxidációs-redukciós (redox) indikátorok, amelyek redox potenciálja megfelelő ahhoz, hogy jelezzék hidrogén-peroxid jelenlétét a peroxidáz enzim jelenlétében. Ilyen indikátorként megemlíthetjük az o-tolidint, sziringaldazint, vanillinazint, a fenol és a 4-aminoantipirin -kombinációját, a 2,7-diamino-fluorént, a benzidint és a benzidin származékait, így például az o-dianizidint. A találmány szerinti kompozíció olyan pufferhatású anyagot tartalmazhat, amely a vizsgált folyadékminta és a kompozíció elegyítése útján kapott rendszerben képes a pH értékét 4 és 9 között tartani. Az 5 előnyös pH-tartomány mintegy 5 és 8 közötti, az optimális pH-érték pedig 6,6. Bármely pufferhatású anyagot alkalmazhatunk, feltéve, hogy a pH említett tartománya tarható és a koleszterin összmennyiségének meghatározásában a vizsgálati kompozíció haté-10 konysága lényegesen nem romlik. A találmány szerinti eljárás alapvetően azzal jellemezhető, hogy a vizsgált folyadékmintát a fentiekben ismertetett valamelyik megfelelő összetételű vizsgálati kompozícióval érintkeztetjük, majd megfigyeljük a 15 jelentkező eredményt (választ). Ez az eredmény vagy válasz eíőnyösen valamilyen kolorimetrikus válasz vagy színváltozás, ami a fentiekben ismertetett indikátoranyagok alkalmazásának következménye. Az alkalmasan megválasztott összetételű vizsgálati kompozí-20 ciót a vizsgált folyadékmintával számos módon érintkeztethetjük, így például a folyadékmintának a vizsgálati kompozíciót tartalmazó valamilyen oldattal, például vizes oldattal végzett elegyítése útján. A vizsgálati kompozíció lehet száraz állapotban is, így 25 például liofilizált állapotban, és közvetlenül hozzáadható a folyadékmintához, vagy az utóbbihoz való hozzáadása előtt rehidrálható, azaz vízben újra feloldható. Miként említettük, a vizsgálati kompozíció felvihető vagy bedolgozható valamilyen hordozóba, ,30 így például abszorpcióra képes csík vagy párna impregnálása útján, amikor is indikátoreszközt kapunk. Egy ilyen eszköz azután bemártható a vizsgálni kívánt folyadékmintába annak érdekében, hogy a folyadékminta a vizsgálati kompozícióval érintkezzék. 35 Előnyös, ha a vizsgálati kompozíció komponensei és a folyadékminta közötti reakciót megfelelő időintervallumon át hagyjuk végbemenni annak érdekében, hogy megbízható és kellően érzékeny eredmények elérésére megfelelő kolorimetrikus elváltozás 40 vagy válasz kifejlődését elősegítsük. Ennek az inkubálásnak az időtartama mindössze mintegy egy perc és legfeljebb egy éjszakának megfelelő időtartam között változhat. Ha a hidrogén-peroxid kimutatására a fentiekben már ismertetett előnyös módszereket alkal-45 mázzuk, akkor az inkubálás időtartama rendszerint mintegy 0,5^ óra és 1 óra között változhat mintegy 0 °C és 50 °C közötti, előnyösen mintegy 37 °C hőmérsékleten. Ha a vizsgálati kompozíció és a folyadékminta keverékéhez valamilyen savas anyagot, 50 így például kénsavat adunk, akkor vizsgálataink tanúsága szerint az előnyös összetételű vizsgálati kompozíciót alkalmazva a színváltozás mértéke nagyobb. Mint említettük, félkvantitatív eredményeket kapunk, ha a vizsgálat eredményét vagy a választ 55 vizuálisan figyeljük meg és összehasonlítjuk olyan szabványosított színmintakártyával, amely illusztrálja a koleszterin ismert összmennyiségének alkalmazása esetén mutatkozó színváltozásokat. Kvantitatív eredményekhez jutunk abban az esetben, ha a kolorimet-60 riás változás meghatározására spektrofotometriai vagy fényvisszaverési módszereket alkalmazunk, majd az így kapott eredményeket szabványosított görbéhez hasonlítjuk. Elengedhetetlenül szükséges, hogy ha a vizsgálati 65 kompozíció fehérjéket, enzimeket tartalmaz, akkor a
