170185. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3- (szubsztituált) -metil-7- acilamido- 7-metoxi- cef- 3-em-4-karbonsav származékok előállítására
170185 17 18 karbamoil-oxi-metil-7-metoxi-A3 - cefem-4-karbonsav-dibenzhidril-észtere A 16. példa B műveleténél leírt eljárással 3-brómmetil- 7-metoxi-7-(2-tienil-acetamido)-A3 - cefem4-karbonsav-1-oxid triklór-etil-észtere helyett ekvivalens 5 mennyiségű 70-(D-5-N-tercier-butoxi-karbonil-amino-3-karboxi-valeramido)-3-klór-metil-7-metoxi-A3 -cefem-4-karbonsav-dibenzhidril észtert alkalmazva 7(3-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-3- karbamoil-oxi-metil-7-metoxi-A3 -cefem4-karbonsav-dibenzhidril észterét 10 kapjuk. Eljárás szulfoxidok redukciójára 7-Metoxi-3-karbamoil-oxi-metil-7-(2-tienil-acetamido> A3 -cefem-4-karbonsav triklór-etil-észtere 15 0,581 g (1 mmól) 7-metoxi-3-karbamoíl-oxi-metil-7-(2-tienil-acetamido)-A3 -cefem4- karbonsav-1 -oxidtriklór-etil-észter, 5 ml acetonitril és 2 ml dimetil-formamid oldatát 0°C-ra hűtjük, melyhez 0,153 g (1 mmól) sztanno-kloridot és 0,3 g (0,38 mmól) acetil- 20 kloridot adunk. A reakcióelegyet 1 óra hosszat 0 °C-on, majd további 1 óra hosszt szobahőmérsékleten keverjük. Az acetonitrilt vákuumban eltávolítjuk és a maradékot vízre öntjük. A vizes oldatot etil-acetáttal extraháljuk, a szerves fázist 3%-os sósav-oldattal, 5%-os 25 nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és ezután vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton szárítjuk és szűrjük. Az oldószer vákuumban történő bepárlásával a 7-metoxi-3-karbamoil-oxi-metil-7-(2-tienil-acetamido)-A3 cefem-4-karbonsav triklór-etil-észterét kapjuk. 30 Eljárás a szabad sav előállítására 7-M e t o xi-3-ka r b amoü-oxi-metil-7-(2-tíenil-acetamido>A3 -cefem-4- karbonsav 90%-os vizes ecetsavban 0,558 g (1 mmól) 7-met- 35 oxi-3-karbamoil-oxi-metil-7-(2-tienil-acetamido)- A3 -cefem-4-karbonsav-triklór-etil-észterét oldjuk és 1 g cinkporral kezeljük. A reakcióelegyet 3 óra hosszat 5—10 °C-on keverjük, a cink eltávolítására szűrjük és az elegybe 5 percig hidrogén-szulfidot vezetünk. A 40 cink-szulfidot leszűrjük és a szűrletet vákuumban bepároljuk. A nyers terméket metanol-etil-acetát elegyből átkristályosítva 7-metoxi-3-karbamoil-oximetil-7-(2-tienil-acetamido)-A3 - cefem4-karbonsavat kapunk. 45 Kiindulási anyagok előállítása 7-Metoxi-3-metoxi-metil-7-(2-tienil-acetamido)-A3 -cefem-4-karbonsav A művelet: 7/?-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-3- 5C karbamoil-oxi-metil-7-metoxi-A3 - cefem-4-karbonsav mononátriumsója Módosított fermentációs eljárás: 1. művelet: Ferde-ágár-tenyészet 55 Streptomyces lactamdurans (MA-2908) tenyészet liofilizált anyagát tartalmazó kémcsövet aszeptikusán kinyitjuk és a mikroorganizmust a következő összetételű tápoldatba átvisszük: XI. közeg: 60 1 % Blackstrap melasz 1 % National Brewer élesztő 2,5% Dirco agár pH 7-0 vízzel feltöltve A ferde-tenyészetet 7 napig 28 °C-on inkubáljuk. 65 Amennyiben hidegen tároljuk, úgy a ferde-ágár-tenyészet több mint 13 hétig stabil. 2. művelet: Oltási szakasz: Kétszakaszos rendszer Első oltás: 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba levő 40 ml 1%-os Primary Dried Yeast N.F., pH 7-0 (Yeast Product Corporation terméke) első oltást az 1. művelet ferde-tenyészetével közvetlenül beoltjuk. A lombikot 2—3 nap hosszat, 28 °C-on, 220 ford/perc sebességű és 5 cm kitérésű rázógépen rázzuk. Második oltás: az első oltási szakasz 2,5% beoltott anyagát 2% Fleischmann S—150 élesztő-autolizátumot (pH 7,0) tartalmazó lombikba adjuk. A tenyészet szaporítása ebben a szakaszban igen könnyű és az inkubációt az első szakasz műveletével azonos módon folytatjuk le, azzal a különbséggel, hogy az inkubáció a 48 órát nem haladja meg. 3. művelet: Termelőközeg A termelőközeg literenként desztillált vizet és a következő anyagokat tartalmazza: 30 g Distiller's solubles; 7,5 g Primary Dried Yeast N. F. és 0,25% (térf/térf) Mobilpar-S habzásgátló. A közeget kis mennyiségű, tömény nátrium-hidroxid-oldattal pH 7,0-ra beállítjuk, Erlenmeyer-lombikba töltjük, melyet autoklávban 15—20 percig 121 °C-on kezelünk. Lehűlés után a közeget a 2. szakasz 2,5% anyagával beoltjuk. Az inkubációs idő 50 és 100 óra között változhat, de előnyös a 72 óra hosszat tartó inkubáció. Minden lombikban a közeg térfogata 30—50 ml között változhat, de a gyakorlatban 40 ml-t alkalmazunk. Az oltóanyag mennyisége 1—5% között változhat, a gyakorlatban általában 2,5%-ot alkalmazunk. 4. művelet: Vizsgálat A fermentáció befejezése után a sejteket centrifugálással eltávolítjuk és a fermentlevet pH 7,0 foszfátpufferrel hígítjuk. A fermentlé 7|3-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-3 - (karbamoil-oxi-metil)-7-metoxi-3-cefem4-karbonsav koncentrációját standard biológiai korongvizsgálati módszerrel határozzuk meg. Teszt -organizmusként Vibrio percolans-t (ATCC 8461) alkalmazunk. A szűrőpapír-korongokat a hígított fermentlébe mártjuk, majd Petri-csészében levő ágártenyészet felületére helyezzük, melyet Vibrió percolans (ATCC 8461) teszt-organizmussal történő beoltásával kapunk. A további Petri-csészékbe olyan szűrőpapír-korongokat is helyezünk, melyeket előzőleg ismert koncentrációt tartalmazó 7/3-(D-5-amino-5-k arboxi-valer amido)-3-(karbamoil-oxi-metil)- 7-metoxi-3-cefem- 4-karbonsav standard oldatába merítünk. A csészéket 1 éjjelen át 28 °C-on inkubáljuk és a gátlási zónaátmérőket feljegyezzük. A fermentlé koncentrációját a standard görbéből, az ismert koncentrációjú standard oldatok zónaátmérőihez viszonyítva határozzuk meg. Ezzel a módszerrel meghatároztuk, hogy a módosított fermentálási eljárással a Sterptomyces lactamdurans MB-2908 78,6 /ig/ml 7j3-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-3-karbamoil-oxi-metil-7-metoxi-3-cefem4-karbonsavat termel. 5. művelet: Elkülönítés A szűrt fermentlevet hígított sósav-oldattal 7,0 pH-ra beállítjuk és 2900 ml-t 100 g stirol-divinil-benzol alapú, erősen bázikus anioncserélő gyantával (Dowex 1X2, klorid-ciklusú gyanta) töltött oszlopon 10 ml/perc sebességgel átfolyatjuk. Az áteresztett oldatot 500 ml-es frakciókban felfogjuk. A gyantaosz-9
