170113. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú bakteriális alfa- amiláz és/vagy semleges proteáz, valamint lúgos proteáz előállítására
3 170113 4 tisztítását teszik lehetővé. Kísérleteinkben 3S-IV Jelű Bacillus subtilis törzzsel az OKI-nál /Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye/ deponálva 1971. február 8-án 63 letét számon/, valamint AN-148/4 jelű Bacillus subtilis törzzsel az OKI-nál /Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye/ 1975. március 7-én deponálva, ool34 letét számon/, a 164.880 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett technológia szerint előállított alfa-amiláz, neutrális proteáz, illetve lúgos proteáz szorpciós készségét vizsgáltuk a 165.669 sz. magyar szabadalmi leirás szerint előállított szorbensen. A kísérletekben használt enzimek aktivitását a következő módszerekkel határoztuk meg: alfa-amiláz aktivitás: Smith és Roe módszerével /J.Biol.Chem.179, 53, 1949/; semleges és lúgos proteáz aktivitás: Anson módszerével /J.Gen.Physiol.22,79, 1939/. Az enzim aktivitási értékek égisz számokban történő kifejezése érdekében, a proteáz aktivitásokat Egység-ben /E/, illetve mE-ben fejeztük ki /looo mE = 1 E/. Eljárásunk haladó voltának igazolására, az általunk előállitott enzim-készitmények aktivitását nemzetközileg ismert enzim-készitmények aktivitásával hasonlítottuk össze. Az "Enzimfejérje ekvivalenst" a következő képlettel számitottuk ki: Saját készítmény specifikus aktivitása « loo Nemzetközileg ismert készítmény specifikus aktivitása Az összehasonlításnál használt enzimkészitreények a következők voltak: Kristályos NOVO proteáz: specifikus aktivitás 25 Anson E/g. Irodalom: Novo Enzymes /197o/, 28.0. Kristályos NAGASE-alfa-amlláz: specifikus ak-tivitás 8000 Smith-Roe E/g. Irodalom: Nagase katalógus /197o/. Azonos körülmények között vizsgálva a szorbensek specifikus szorpcióképességét, arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy egy optimális előpolimerizációs idejű szorbens mintegy 6,5-szeresen felülmúlja az irodalomból eddig ismert hasonló tipusu gyanták szorpciőkészségét /Izv.Akad.Nauk SSSR, szer. him. 2, 469 /1969/; Chem.Abstr. 48, 229o C; 19.430" sz.szovjet szabadalmi leira"s/ egészen magas specifitás mellett, azzal a nagy előnynyel, hogy a szorbeált enzimek megfelelő körülmények között kis térfogatban kvantitative eluálhatók. A találmányban ismertetett eljárás uj, mert a 165.669 sz. magyar szabadalmi leirás alapján előállitott gyantát mi használtuk elsőként a kísérleteinkben használt enzimek megkötésére. Az eljárás haladó volta abban jut kifejezésre, hogy az előbbiekben ismertetett enzim-koncentrálási, illetve tisztitási eljárásokhoz képest a gyanta nagy kapacitása miatt, a feldolgozás első lépésében az eddig ismert megoldásokhoz képest megközelítőleg tizszer koncentráltabb enzimoldatok állíthatók elő olyan nagyfokú tisztaságban, amely lehetővé teszi a kristályos enzim-készitmények igen gazdaságos előállítását. A fentiek alapján kiválasztott gyanta kötőképességét vizsgáltuk +4 C°-on különböző kation it formában /H , Na+, Ca++, Mg++ / különböző pH értékeknél. Arra a megállapításra jutottunk, figyelembevéve a fenti enzimeknek a fermentációs anyagban aktuális stabilitási értékét a megfelelő pH-n, hogy a kötőképesség a gyanta Na+ formájában, pH 4,5-6,5 értéknél optimális. A szorpció-növekedésnél a visszanyerhető aktiv enzim mennyiségét vettük mérvadónak, tekintettel az alacsony pH-n bekövetkező esetleges inaktíválódás okozta látszólagos szorpció-növekedésre. A gyantát a kötés előtt a megfelelő pH-ra beállitottuk. Vizsgáltuk továbbá a szorpciókészaég és a fermentációs anyag Ca++ tartalma közötti öszszefüggést, és arra a megállanitásra jutottunk, hogy a fermentációs anyag Ca"'"''' TARTALMA o,l-8 mg/ml határok között a kötőképességet és az eluálhatóságot lényegesen nem befolyásolja. Vizsgálataink szerint a specifikus szorpciőkészségét lényegesen nem befolyásolja a férjik mentációs anyag előkészítésének kétféle változata. A csak centrifugált fermentációs anyagokra nézve a specifikus szorpciókészség közelítőleg egyezik a Ca-foszfát géllel szűrt fermentációs anyag értékével. A szorbeált enzimek eluálhatóságát vizsgálva, azonos körülmények között, +4 C°-on, a különböző előpoli-10 merizációs idejű gyantákon maximális szorpciónál kaptuk a legjobb eluálhatóságot. Az enzimek eluálhatóságát a 6,5-11 pH intervallumban különböző ionerősség mellett vizsgáltuk. Arra a megállapításra jutottunk, hogy legkisebb térfogatban a magasabb pH-tartományban tudtuk eluálni az enzimet o,3 M ionerősség '•* mellett. Az eluátum a kötött enzimet csaknem kvantitative tartalmazza az eredeti oszlopon kötött fermentációs anyag térfogatához viszonyítva mintegy 15-2o-szor kisebb térfogatban. /Megközelítőleg ez a gyanta térfogat szükséges a 9o-98 *-ps szorpció eléréséhez./ Az e-20 luátumból +4 C -on szerves oldószerrel kicsaphatok az enzimek. Szűrés vagy szeparálás után a kapott csapadékot levegőn szárítjuk. Az igy kapott termék aktivitása alapján számolva - a kristályos enzimek aktivitását figyelembevéve - az alfa-amllázt és neutrális _ proteázt tartalmazó por alfa-amilázra számit^ va kb. 3o %, neutrális proteázra számítva kb. 35 $> kristályos enzimfehérjét tartalmaz. A csak lúgos proteázt tartalmazó por kb. 55 í kristályos enzimfehérjét tartalmaz. Ez a tisztasági fok előnyös az enzimek elkülönítése, valamint még nagyobb tisztaságban való 30 előállítása szempontjából. Kutatásaink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy további tisztitási müveletek nélkül egymagában szerves oldószeres frakoionálással magas aktivitású amiláz és proteáz termék elkülönitása és kinyerése végezhető el, ha azt megelőzően az enzimek mel-35 lől anioncserélőként ismert cellulózszármazékok egyikével ma még ismeretlen anyagokat /ezen belül különböző pigmenteket/ távolítunk „el az oldatból. A felismerés lényege, hogy a szerves oldószeres frakcionálás előnyeit csak akkor lehet 4r) a Bacillus subtilis alfa-amiláz és neutrális proteáz enzimeinek elkülönítésére és rövid uton nagy tisztaságban való előállítására kiaknázni, ha az enzimeket tartalmazó oldatot megelőzően anioncserélő cellulózzal sajátos körülmények között előkezeljük. Ilyen előkezelés nélkül kalciumionok jelenlétében elvég-45 zett szerves frakoionálással nem érhető el számottevő enzimelkülönités. Gyengén bázikus anioncserélő gyantákat, igy Duollte A-2 és A-7, illetve dietilamino-etilcellulózt alkalmaz Keay, Kóser és 'Tildi /Biotechnol.Bioeng. 12, p. 213-249 /197o/ Bacillus subtilis fermentléből történő pro-50 teáz izolálási műveletsor egyik lépésében pigmentek eltávolítása céljából. A 3.592.738 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leirás szerint semleges és lúgos proteáz tisztítására Duolite C-lo szulfonált fenolformaldehid gyantát illetve DEAE-cellulózt és cc nátriumkloridos eluciót alkalmaznak. A fermentleben levő pigmenteket pH 6,4 mellett kötik meg az emiitett ioncserélőkön. A 2.952.586 sz. Amerikai Egyesült Államok-béli szabadalmi leirás szintén Duolite A-2, illetve A-7 tipusu gyengén bázisos ioncserélő gyantákat alkalmaz a pigmentek eltávolitásáoO ra. Biológiai eredetű levek festékmentesitésére emellett más tipusu polimerek is használatosak, igy a különféle poliamidok /841.574 sz. kanadai szabadalmi leirás, 3.3o8.o28 sz. Amerikai Egyesült illamok-beli és 1.2o7.o45 sz. NSZK-beli szabadalmi leirás/. Q5 Eljárásunk szerint a nagytisztaságu bakteriális alfa-amiláz és/vagy neutrális proteáz, valamint lúgos proteáz előállítása az előzőekben leirt ionogen szubsztituens tartalmú
