170113. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú bakteriális alfa- amiláz és/vagy semleges proteáz, valamint lúgos proteáz előállítására

5 170113 6 polikondenzációs szorbenssel történik a megfelelően előkészített oldatból, illetve fermentációs anyagból, A fermentációs anyag térfogatára számolva előnyösen 1-5 #, célszerűen 1,5 í> kalciumkloridot keverünk be, majd az elegyet 1,5-2 órán át állni hagyjuk. A kivált csapadékot centrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk. így a fermentációs anyag kalciumtartalma p,l-8 mg/ml. A szorpciót előnyösen pH 4,5-6,5 között, célszerűen pH 5,2 értéken o,l M foszfátpufferrel hasonló értékre pufferolt kationit formában levő szorbenssel +4 és +2o C° hőmérsékletek között végezzük. A szorpciót követő elució előnyösen pH 7,2--lo,5 értéken o,l-o,5 M ionerősség mellett, célszerűen pH lo,o értéken o,3 M ionerősség mellett ammonias pufferrel történik. A szorpció és az elució létrehozható bekeveréssel is. Az eluátumot vizzel elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen 2-5, célszerűen háromszoros térfogattal +3 és +lo C° között kicsapjuk, szűrjük, kevés alkohollal átmossuk és szárítjuk. A kapott por nagytisztaságu, aktivitása amilázra 25oo-35oo E/mg, proteázra 6-9 E/g. A csak alkalikus proteáz tartalmú fermentációs anyagból 9-13 E/g aktivitású port kapunk. A találmány szerinti tisztítási eljárás értelmében az eljárás első szakaszában szereplő ioncserélő oszlopról kapott eluátumot vagy a szerves oldószeres kicsapásával kapott nagytisztaságu anyag desztillált vizes oldatát pH 8-8,5 értékre állítjuk be, átengedjük OH ciklusra aktivált és vizzel kimosott cellulóz alapú anioncserélőn, előnyösen dietilamino-etilcellulózon. Az átfolyó oldathoz o,2-2 # kalciumkloridot, majd azonos térfogatú etilalkoholt adunk és a kiváló amiláztartalmú csapadékot elkülönítjük; a felüluszó folyadékból további etilalkohol hozzáadásával 66-80 térfogat fí kicsapószer koncentráció-határok között a proteázt kicsapjuk és elkülönítjük. Fontos jellemzője a találmány szerinti tisztítási eljárásnak az, hogy az ismertetett eljárásoktól eltérően az anioncserélővel végzett kezelés nem neutrális vagy ahhoz közelálló pH tartományban, hanem lúgos, pH 8-9,5 közegben történik. Az anioncserélőnek ilyen körülmények melletti alkalmazhatósága és eredményessége azért meglepő, mert ilyen magas pH értékek mellett ennek, mint ioncserélőnek a disszociációja erősen visszaszorul, ennek ellenére - a róla eluálható anyag vizsgálata alapján - a rajta átfolyt oldatból olyan nagymennyiségű anyagot köt meg, amely mint ioncserélőnek kapacitás-adatait messze meghaladja. Ennek alapján eljárásunkban cellulóz alapú anioncseréló abszorbensnek tekinthető, de az amiláz és a proteáz szempontjából fajlagosnak, mivel az alkalmazás körülményei között ezen enzimek egyikét sem tartja vissza, ugyanakkor eltávolítja a szerves oldószeres frakcionálási zavaró tényezőket. Ezt támasztja alá, hogy egyéb anioncserélő gyanták a festékanyagok mellett tekintélyes mennyiségű enzimet is visszatartanak. Ily a Duolite A-2 gyanta /granulált alifás amingyanta, gyengén bázikus anioncserélő/ pH 5,8-on az amilázt is megköti /Agr.Biol.Chem. 3o, 0.651 /1966/; 3iotechnol. Bioeng.12, p.179-212 /197o/ . A B. subtilis proteáz előállítását célzó eljárásban is a dietilaminp-etilcellulózos kezelés pH=6,4 értéken ugy szerepel, mint az amiláz és a pigment eltávolitásának egyik módja. Kísérleteink során a cellulóz alapú anioncserélők előnyeit sem cellulóz, sem kationcserélő cellulóz-származékok alkalmazásánál nem tapasztaltuk. A találmány szerinti eljárásban lényeges szempontként említhető a tisztitásnál az is, hogy az oldat az anioncserélő cellulózon való átfolyatás előtt nem tartalmazhat kalcium-ionokat. Ennek jelenléte - miként az a fent emiitett ismert eljárásokban szerepel - rontja a cellulóz-származék hatásosságát, igy a következő etilalkoholos kicsapás és enzim-elválasztás eredményessége csökken. Eljárásunk szerint kalciumsót csak közvetlenül a szerves oldószeres frakcionálás lépésében teszünk a közeghez. A találmány szerinti tisztítási eljárás előnye, hogy nyers amiláz-proteáz keverékből lényegében két műveleti lépéssel képes elkülönítve amiláz és proteáz enzimet szolgáltatni. Az amiláz a mint szélesebb felhasználási c terület miatt az iparilag értékesebb enzim, mely előbb és alacsonyabb kicsapó-szer koncentrációnál nyerhető ki az eljárás során, mint a proteáz, igy a módszer gazdaságossága az amilázra nézbe különösen előnyös. Az eljárással magas fajlagos aktivitású /7-8ooo E/mg/ amiláz nyerhető, amely közvetlenül krisfályo-10 sodik. A termék proteáz-szennyezettsége legfeljebb 0,4 E/g. Hasonlóan magas, legalább 15 E/g aktivitású a proteáz termék, ez amilázt gyakorlatilag nem tartalmaz. A gyakorlatilag tiszta amiláz és proteáz között 55-66 térf.% alkohol töménységnél kiválik ugyan egy amiláz-proteáz keverék, ez azonban a találmány 15 szerinti szétválasztási eljárás megismétlésével komponenseire bontható, és igy a tiszta amiláz és tiszta proteáz termelése jelentősen növelhető. Alkalmas lehet ez az enzimkeverék a szenynyezésektől való nagyfokú tisztítottsága foly-20 tán egyéb célú, pl. gyógyászati emésztő-enzim készítményhez való felhasználásra is. Eljárásunkat a példákban részletezzük, anélteül azonban, hogy eljárásunkat a példákra korlátoznánk. PÉICÍI 25 1./ BS/IV jelzésű Bacillus subtilis törzszsel az/OKI-ban deponálva 1971.február 8-án, 63 letéti számon/ a 164.880 sz. magyar szabadalmi leírás alapján előállított fermentlé /alfa-amiláz aktivitása 684o E/ml, meutrális proteáz aktivitása 24 mE/ml/ térfogátása számitva 1,5 % kalciumkloridot keverünk be, majd 30 1,5-2 órán át állni hagyjuk. A kivált csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. Az igy előkészített fermentlé 1-3 mg/ml kalcium iont, 57oo E/ml amilázt és 2o mE/ml proteázt tartalmaz. 2 M pH = 3,5 nátriumaeetát-ecetsav pufferrel a pH-ját 5,2 értékre állitjuk. A maxi.-.,- malis specifikus szorpciókészséggel rendelke•" ző gyantát Na formába hozzuk. A nátrium formában levő pH-5,2 o,l M foszfátpufferrel egyensulyba hozott ioncserélő oszlopon az előkészített fermentlevet 0,66 ml/perc/cnf sebességgel +4 C°-on engedjük át. Az ioncserélő gyanta kötőképessége amilázra lo5.5oo E/ml 40 gyanta» proteázra 279 mE/ml gyanta. 2./ Mindenben az 1. példában leirt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a gyantát 4,5 pH-ra egyensúlyozzuk ki, a fermentlé pH-ját 4,5 értékre állitjuk. Igy az ioncserélő gyanta kötőképessége amilázra lo9.11o E/ml, proteázra 371 mE/ml. 45 3./ Mindenben az 1. példában leirt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a gyantát 6,5 pH-ra egyensúlyozzuk ki, és a fermentlé pH-ját ammóniumhidroxiddal pH=6,5 értékre állitjuk. Igy az ioncserélő gyanta kötőképessége amilázra 58.600 E/ml, proteázra 15 mE/ml. 50 4./ Mindenben az 1. példában leirt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogyha fermentlé kalciumtartalmát 5 mg/ml értékre állitjuk be. Igy az ioncserélő gyanta kötőképeasége amilázra 66.15o E/ml gyanta, proteázra 254 mE/ml gyanta. 5./ Mindenben az 1. példában leirt módon t>b járunk el, azzal a különbséggel, hogy a fermentlé kalciumtartalmát 8,6 mg/ml értékre állitjuk be. Igy az ioncserélő gyanta kötőképessége 47.250 E/ml gyanta, proteázra 31o mE/ml gyanta. 6./ Mindenben az 1. példában leirt módon gO járunk el, azzal a különbséggel, hogy a gyantát belekeverjük a fermentlebe. Igy az ioncserélő gyanta kötőképessége amilázra 46.35o E/ml, gyanta, proteázra 223 mE/ml gyanta. A bekeverés időtartama 1 óra. 7./ Mindenben az 1. példában leirt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy AB-148/ 65 /4 jelű Bacillus subtilis törzzsel /az OKI-ban deponálva 1975. március 7-én, 00I34 letéti számon/ előállitott fermentlevet /lúgos 3