170113. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú bakteriális alfa- amiláz és/vagy semleges proteáz, valamint lúgos proteáz előállítására

MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS SZOLGÁLATI TALÁLMÁNY Bejelentés napja: 1972. IX. 22. (CI-1276) Módosítási elsőbbsége: 1975. IV. 1. (4504) Közzététel napja: 1976. XI. 27. Megjelent: 1978.1.17. 170113 Nemzetközi osztályozás: C 12 D 13/10 C 07 G 7/028 Feltaláló: dr. Horváth István, vegyész, 20%, Bátkai László, vegyész, 18%, dr. Szántó József, vegyészmérnök, 10%, Li Valentina, vegyészmérnök, 10%, dr. Horváth Istvánná, vegyész, 5%, Inczefi István, biológus, 4%, dr. Tolnay Pál, vegyészmérnök, 5%, Kaufer László, vegyésztechnikus, 5%, dr. Cseh György, orvos, 5%, Piukovich Sándor, vegyész, 6%, Stankovics Lajos, vegyész, 6%, dr. Járai Miklós, biológus, 6%, Budapest Tulajdonos: Chinoin Gyógyszer- és Vegyészeti Termékek Gyára, Rt., Budapest Eljárás nagytisztaságú bakteriális alfa-amiláz és/vagy semleges proteáz, valamint lúgos proteáz előállítására 1 Á találmány tárgya eljárás nagytisztaságu *bakteriális alfa-amiláz és/vagy neutrális proteáz, valamint lúgos proteáz előállítására, azzal jellemezve, hogy a fermentleben oldott állapotban levő bakteriális alfa-amilázt, neutrális proteázt, illetve lúgos proteázt szabályozott porozitású, ionogén szubsztituenst tartalmazó polikondenzációs fenolgyanta segítségével savanyu pH-n kötjük meg, a megkötésnél alkalmazott pH értéknél magasabb pH értéken eluáljuk, az eluátumot kivánt esetben cellulóz alapú Ioncserélő alkalmazásával tisztítjuk, az alfa-amilázt, neutrális proteázt, illetve lúgos proteázt fehérjekicsapó szerekkel, kivánt esetben frakcionáltan, kicsapjuk és a csapadékot szűrjük, majd szárítjuk. Ismeretes, hogy a fehérjék és a fehérje tartalmú enzimek nagy molekulasúlyú amfoter vegyületek, melyek rendkívül hajlamosak térszerkezetük változása miatt biológiai tulajdonságaik, Így enzimaktivitásuk elvesztésére. Emiatt azok az ioncserélő gyanták, amelyek erős kötés létrehozására képesek a fehérjékkel és nagymennyiségű fehérjét képesek megkötni, a fehérjék tisztítására és/vagy koncentrálására nem alkalmasak, mert az abszorpció és eluálás olyan közeget igényel, mely a biológiai aktivitás elvesztéséhez, a fehérjék denaturálásához vezet. Gyengébb ionos jellegi! csoportokat tartalmazó gyantákat a cellulóz és dextrán származékokat kiterjedten alkalmazzák fehérjék tisztítására /Biölechnol.Bioeng. 12, p. 179-212, p. 213-249, p. 251-271 /197o/. Az alkalmazott gyanták felhasználása azonban a mikrobiológiai enzim termelésnél nem gazdaságos, mert az enzimek megkötése és eluálása nem vezet jelentékeny térfogatcsökkenéshez, sőt ha előzőleg más módszerrel, bepárlássál, kisózással, poliion jellegű kicsapással, vagy szerves oldószeres kicsapással töményitjük az enzim ol-170113 10 15 20 25 30 datot, melynek további tisztítása a fent jelzett anyagokkal megoldható, ipari enzim termelés céljára az eljárás a magas költségigény miatt nem alkalmas. Legfeljebb a finomvegyszer-készités céljaira forgalomba kerülő preparátumok magas ára teszi lehetővé e gyanták alkalmazását. E találmány kidolgozói feladatul tűzték ki olyan e célra előállított ioncserélő jellegű szorbensek alkalmazását, melyek nagy kapacitással képesek hig oldatokból a fehérjéket, elsősorban bakteriális enzimeket megkötni és ezen szorbensekről a megkötött fehérjék, enzimek kis térfogatban aktiv állapotban leoldhatok, lehetőleg ugy, hogy a két egymást követő lépés egyúttal nagyfokú tisztasághoz vezessen, és Így a szokásos módon kicsapással elkészített végtermék ipari célra közvetlenül felhasználható legyen, de lehetővé váljék éppen az elért nagy tisztaság miatt, hogy a fehérjék, enzimek további tisztítása, esetleg kristályos formában való előállítása ipari méretben megoldható legyen. Egyúttal rá kell mutatnunk arra a tényre, hogy a különböző mikroorganizmusok és általánosabban különböző élő szervezetek által termelt fehérjék és enzimek szerkezetileg rendkívül nagy eltéréseket mutatnak ionizáló csoportok és térbeli szerkezet szempontjából és igy nem várható egy olyan általános jellegű gyanta felfedezése, mely a fent felállított követelményeknek minden esetben megfelel. Az általunk alkalmazott ionogén szubsztitueiís tartalmú gyanták bakteriális eredetű alfa-amiláz és/vagy neutrális proteáz, valamint lúgos proteáz nagy tisztaságban való egyszerű kinyerését és a kapott termékeknek az irodalomból ismert eljárásokhoz /1.2o7.o45 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás, 841.574 sz. kanadai szabadalmi leírás, 19.43o sz. szovjet szabadalmi leírás/ viszonyítva egyszerűbb