170005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parvulin előállítására mikrobiológiai úton

3 170005 4 A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás magas parvulin-tartalmú fermentlevek előállítására süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, nitrogén- és szénfonást, szervetlen sókat, valamint habzásgátlót tartalmazó táptalajon, 26-32 C°-on, előnyösen 28 C°-on Streptomyces parvulus var. parvuli (MNG 36) mikroorganizmussal, amely abban áll, hogy a mikroorganizmus desztillált vízzel készült spóraszuszpenzióját 300-3600 /ig/ml parvulint-sót tartalmazó táptalajon tenyésztjük, majd a szokásos módon elvégezzük a fermentációt, ugyanakkor ez a nagyobb termelőképesség hosszú időn át beavatkozás nélkül megmarad. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy burgonyakivonat-glükóz-agaron fenntartott Streptomyces parvulus var. parvuli MNG 36 spóráiból vizes szuszpenziót készítünk. A táptalajdarabok eltávolítására szűrjük a szuszpenziót, homogenizáljuk, majd steril vízzel hígításokat készítünk. A hígított szuszpenziókat növekvő mennyiségű parvulin-káliumsót tartalmazó burgonyakivonat-glükóz-agarra szélesztjük, majd inkubáljuk a tenyészeteket. Az inkubációs idő letelte után hasonló táptalajból készült ferdeagarokra oltjuk a legtöbb parvulint tartalmazó tenyészetek egy-egy telepét, majd ismét inkubáljuk a tenyészeteket. Megfelelő mértékű növekedés után hűtőszobába helyezzük őket, egy részükkel pedig szerves nitrogén- és szénforrást, továbbá szervetlen sókat tartalmazó, 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikban sterilezett táptalajokat oltunk. A tenyésztést rázóasztalon, 28 C° hőmérsékleten végezzük 6 napon át. Ekkor a tenyészetek parvulin-tartalma 6,5,mg/ml. A tárolt ferdeagar tenyészetek egy részével az oltást követő 4., 8. és 12. héten megismételjük a rázott lombikban sterilezett táptalajon való tenyésztést, amikor milliliterenként, sorrendben, 6,3 mg, 6,6 mg és 6,1 mg parvulint tartalmazó tenyészleveket kapunk. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint nagy mennyiségű parvulin előállítására úgy járunk el, hogy a burgonyakivonat-glükóz-agaron nőtt Streptomyces parvulus var. parvuli MNG 36 steril vízzel készült spóraszuszpenziójával szerves nitrogén- és szénforrást, továbbá szervetlen sókat és előnyösen habzásgátlót tartalmazó, növekvő mennyiségű parvulin-ammóniumsó steril vizes oldatával kiegészített táptalajokat oltunk, majd 28 C° hőmérsékleten rázóasztalon tenyésztünk. 24 óra múlva, a sterilitás és a növekedés ellenőrzése után, steril desztillált vízzel megfelelően hígítva, növekvő mennyiségű parvulin-ammóniumsót tartalmazó burgonyakivonat-glükóz-agarra szélesztjük a tenyészeteket. Ezután 5-7 napon át 28 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd a legtöbb parvulinsó jelenlétében kifejlődött telepeket parvulin-ammóniumsót tartalmazó, burgonyakivonat-glükózos ferdeagarra oltjuk. 5-7 napon át 28 C° hőmérsékletű termosztátban inkubáljuk a tenyészeteket, majd egy részükkel szerves nitrogén-és szénforrást, továbbá szervetlen sókat és habzásgátlót tartalmazó, 10 liter ossz- és 5 liter hasznos térfogatú laboratóriumi üvegfermentorban sterilezett táptalajt oltunk. A tenyésztést előnyösen 28 C° hőmérsékleten, 5 percenként 520-at forduló keverő működtetése és 5 liter/perc levegőmennyiség átáramoltatása mellett folytatjuk. A habzás gátlására steril disznózsírt adagolunk. A tenyészet az oltást követő 144. órában milli-10 literenként 6,0 mg parvulint tartalmaz. A tenyészlevek parvulin-tartalmát a szokásos módon kivitelezett agar diffúziós biológiai értékméréssel határozzuk meg. Tesztorganizmusként Bacillus subtilis ATCC 6633 jelű mikroorganizmust 15 használunk, az értékméréshez használt táptalaj összetétele: 0,6% pepton, 0,06% élesztőkivonat, 0,15% húskivonat (Oxoid Lab. Lemco), 0,9% agar. A táptalajt desztillált vízzel készítjük, kiöntés előtt pH-ját tömény nátriumhidroxid-oldattal 8,0-ra állít-20 juk be. A mérendő mintákat levegőmentesítés céljából centrifugáljuk, majd 0,01 mólos, 8,02 pH-jú Sörensen-pufferral vagy a pH-nak tömény ammóniumhidroxiddal 8,5 - 8,7-re való beálb'tása után 0,2%-os vizes kalciumklorid oldattal megfelelően 25 hígítjuk. Az agarlemez 1 cm átmérőjű lyukaiba 0,1 ml, körülbelül 0,2 jug parvulint tartalmazó mérendő oldatot mérünk be. 16 órán át tartó inkubáció után leolvassuk a gátlási zónákat, és ismert koncentrációjú oldatok által kapott gátlási zónák 30 átmérőjével hasonlítjuk össze. A parvulin jelenlétében növő és spórázó Streptomyces parvulus var. parvuli MNG 36 tenyésztésekor szénforrásként bármely olyan vegyületet használhatunk, amelyet a mikroorganizmus fel tud 35 használni, előnyösen glicerint, glükózt, keményítőt vagy maltózt adunk a táptalajhoz. Nitrogénforrásként bármely olyan készítményt adagolhatunk a táptalajhoz, amelynek jelenlétében a termelő mikroorganiumus növekedni képes, előnyösen azonban 40 szerves nitrogénforrást, például szójalisztet, mogyorólisztet, kukoricalekvárt, kazeint vagy peptont használunk. A táptalajhoz szervetlen sóként nátriumkloridot, kalciumkarbonátot és magnéziumszulfátot célszerű adni, további kisebb mennyiség-45 ben más, fémionokra disszociáló sókat. A termelést előnyösen befolyásoló nyomelemeket a táptalaj többi összetevője általában már tartalmazza. A tenyésztést 24 C° és 32 C°, előnyösen 26 C° 50 és 30 C° közötti hőmérsékleten végezzük, általában 144 órán át. Ebben az időben a tenyészetek milliliterenkénti parvulin-tartalma 6,0 mg/ml körül van. A tenyészeten átáramoltatott levegő mennyiségét a használt táptalaj összetétele és a készülék mű-55 szaki adatai szerint kell megválasztani. Az optimális levegőztetési viszonyok meghatározása a szakemberek számára nem jelent nehézséget. A táptalajok sterilezését 30-60 percen át túlnyomáson, 121-123 C° hőmérsékleten végezzük, a 60 táptalajok pH-ját sterilezés előtt 6,8 és 7,2 közptti értékre állítjuk be, a sterilezés utáni pH előnyösen 6,8-6,9. A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy segítségével az eddiginél kétszer-háromszor 65 több parvulint tartalmazó tenyészlevek állíthatók 2