169971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinoxidáz előállítására mikroorganizmusokból
3 169971 4 A fenti reakciónak megfelelően az enzimet koleszterinoxidáznak nevezzük. Az enzim aktivitása a fenti reakciót felhasználva könnyen meghatározható például a meghatározott körülmények között képződött H2 0 2 mérése útján. Az enzim specifikus és más szteroidokat nem képes oxidálni. E tulajdonsága alapján az enzim specifikus koleszterinmeghatározási eljáráshoz használható. Ilyen fajta meghatározási módszer eddig nem állt rendelkezésre. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatosítási módja koleszterinoxidáz nyerésére abban áll, hogy koleszterint átalakító mikroorganizmus sejtfalát - adott esetben butanol-víz-eleggyel való mosás után — nem ionogén felületaktív szert tartalmazó pufferoldattal elpusztítva feltárjuk és extraháljuk a sejteket, az extraktumot anioncserélőre visszük fel és az enzimet felületaktív szert tartalmazó pufferoldattal eluáljuk. Az előállított koleszterinoxidáz tulajdonságai: a) A reakció követése: a keletkezett H2 0 2 mérésével. b) Kmkoleszterin = 1,7 • 10 ~4 M (0,5 mólos, pH = 7,5 foszfátpuffer, oxigénnel telítve). c) Mólsúly: kb. 32 000 d) Koenzim: FAD e) pH-optimum: 7,5 f) Gátlás: Hg-ionokkal g) Aktiválás: detergensekkel. A koleszterinoxidáz esetében olyan enzimről van szó, amely egyrészről a mikroorganizmus sejthártyájához kötődik, másrészről egy rendkívül hidrofób anyagot, koleszterint kell átalakítania. Ilyenfajta enzimek a klasszikus előállítási módszereknél különlegesen kellemetlen tulajdonságot mutatnak. A sejthártyából ugyanis rendkívül nehezen szabadíthatók ki és még ha maga a kiszabadítás sikerül is, hajlamosak az összeállásra és az edény falához, fázishatárrétegekhez, vagy az adszorbensekhez és ioncserélőkhöz való kötődésre. Ezért nem lehet az enzimelőállítás és izolálás szokásos módszereit alkalmazni. Különös nehézséget jelent, hogy az enzim aktivitása és specificitása közben nem változhat. Mikroorganizmusként a találmány szerinti eljárás megvalósításához — mint említettük — elvileg minden koleszterint átalakító mikroorganizmus felhasználható. Különösen jó eredményeket érhetünk el a Proactinomyces családba tartozó baktériumokkal és közöttük előnyben részesül a Nocardia erythropolis ATCC 25544, ATCC 17895, ATCC 4277 és Nocardia formica ATCC 14811. A találmány szerinti eljárás azonban ugyanígy más mikroorganizmusokra, baktériumokra, gombákra is alkalmazható, melyek képesek a koleszterin átalakítására. A mikroorganizmusok feltárása a sejtfal detergensekkel való elpusztítása által ismert feltárás és elvileg az erre leírt és a gyakorlatba átment módszerek mind felhasználhatók. A mikroorganizmust nem ionogén felületaktív szert tartalmazó pufferoldattal feltárjuk és extraháljuk. Előnyben részesített nem ionogén felületaktív anyagok az alkilaril-etilénglikolok és polietilénoxid-polipropilénoxid-adduktok, főleg ezek észterei. A feltárásra és extrakcióra használt pufferoldatban a felületaktív szerek koncentrációja bizonyos mértékig függ a mindenkor használt felületaktív szertől 5 és előkísérletek útján meghatározható.- Általában megfelelő 0,01-3%, előnyösen 0,1-1% közötti koncentráció. A pufferoldat pH-értéke 5-9, előnyösen 6-8 között van. A leírt felületaktív szer jelenlétében történő, 10 feltárással kombinált extrakció útján a keresett enzim fajlagos aktivitása százszorosára növelhető, összehasonlítva azzal az aktivitással, ami ugyanazon pufferrel felületaktív szer nélkül, de ultrahangos extrakcióval érhető el. 15 Különösen jó eredményeket kapunk, ha a mikroorganizmust feltárás és felületaktív szer jelenlétében végzett extrakció előtt butanol-víz eleggyel mossuk. Meglepő módon ez a butanol-víz emulziós mosás nem okozza az enzim várt összecsomóso-20 dását vagy denaturálódását a határfelületeken, bár az ilyen eljárás szokásosan összecsomósodásra nem hajlamos enzimeknél már határfelületi feldúsulásokhoz és az aktivitás erős károsodásához vezethet. A találmány szerinti eljárás keretében különösen e 25 mosás által további jelentős dúsítás érhető el. A butanol-víz elegyes mosás egy vagy több lépésben hajtható végre. A találmány szerinti eljárás lépéseinek hatásossága számszerűleg a közönséges ultrahangos feltárás-30 sal összehasonlítva fejezhető ki. így meghatározott mennyiségű mikroorganizmus 0,05M foszfátpuff érrel (pH = 7,0) való ultrahangos feltárásával 30 egység fajlagos aktivitású koleszterinoxidáz nyerhető. Ha ezzel szemben a mikroorganizmus feltárását 35 mintegy 0,5% felületaktív szert tartalmazó foszfátpufferrel végezzük, akkor 60 egység összaktivitást és 1,0 egység fajlagos aktivitást kapunk. Ez a kitermelés megkétszereződésének és százszoros dúsulásnak felel meg. Ha az utóbbi eljárást megismé-40 teljük, de a feltárás előtt butanol-víz eleggyel mosást végzünk, úgy 60 egység összaktivitású és 3,0 egység fajlagos aktivitású enzimet, azaz összesen háromszázszoros dúsulási kapunk. A találmány szerint előállított kivonatot, amely 45 a koleszterinoxidázt oldatban tartalmazza, ezután ioncserélőn tisztítjuk. Kiderült, hogy ez nem vihető keresztül az ilyen jellegű szokásos tisztítási eljárással. Bebizonyosodott ugyanis, hogy az enzim az ioncserélőről többé nem eluálható. Még magas ion-50 koncentrációk alkalmazása mellett sem lehetett az enzimet visszanyerni. Hasonlóképpen nem sikerült az enzim visszanyerése felületaktív szerek oldataival sem. Meglepő módon azonban a puffer és a viszonylag kis koncentrációjú felületaktív anyag kom-55 binációjával az enzim gyakorlatilag tökéletesen lemosható az ioncserélőről. Ioncserélőkként az anioncserélők, különösen a gyenge bázis típusúak alkalmasak. Előnyben részesítjük azokat az ioncserélőket, melyek dietil-amino-60 -etanol-csoportokat tartalmaznak, összehasonlítható bázikusságú más ioncserélők azonban szintén jól beválnak. Az ioncserélőről történő elúciót előnyösen 0,01—0,2 mólos, fentebb megadott pH-jú foszfát -65 pufferrel végezzük el. A felületaktív szer koncent-2
