169971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinoxidáz előállítására mikroorganizmusokból
5 169971 6 rációja előnyösen beleesik a 0,05—2% tartományba. Különösen előnyös a 0,03—0,1 mólos foszfátpuffer, amely 0,2-0,7% nem ionogén felületaktív szert tartalmaz. Az így kapott eluátumból az enzim szokásos módon izolálható, például sókkal vagy szerves oldószerekkel, mint ammónium-szulfát, metanol, stb. történő kicsapással. Az oldószermennyiség csökkentése céljából célszerű lehet az ioncserélő kromatográfia előtt az enzimet az oldatból kicsapni. A kicsapott koleszterinoxidáz újraoldására előnyösen olyan puffert használunk, amely kismennyiségű felületaktív anyagot tartalmaz. Megfigyeltük ugyanis, hogy esetenként a kicsapott enzim újraoldása nagy nehézséget okoz, ami azonban felületaktív szer jelenlétében kiküszöbölhető. A találmány szerinti eljárással az enzim mintegy 3000-szeres dúsítása érhető el. Lehetőség van további tisztításra a szokásos biokémiai finomtisztítási módszerekkel. Amennyiben az enzim közben kicsapódik, vagy a felületeken adszorbeálódik vagy .megkötődik, akkor az ilyen eljárásokat felületaktív szerek jelenlétében kell végrehajtani. A találmány szerinti eljárásnál az ioncserélő elúciója után kapott enzimkészítmény közvetlenül felhasználható a fent megadott reakcióegyenletnek megfelelő kvantitatív koleszterinmeghatározáshoz. Az enzim aktivitását és ezzel a találmány szerinti eljárás hatékonyságát követjük, minthogy a fenti egyenlet szerint képződött H2 0 2 -ot ismert módszerekkel meghatározzuk. Az említett, különösen előnyben részesített mikroorganizmusoknak koleszterinen, mint kizárólagos szénforráson való tenyésztésénél fennáll a probléma, hogy a koleszterin vízoldhatósága nagyon csekély és emiatt a fermentor falain lerakódik. Ennek az a következménye, hogy a szaporodó mikroorganizmusok adszorbeálódnak, bezáródnak és így kilépnek a tápoldatból. Oldószerek, mint alkoholok, ketonok hozzáadásának az a hátránya, hogy ezeket az anyagokat mint szénforrásokat a mikroorganizmusok előnyben részesítik és ezáltal a koleszterinoxidáz-tartalom erősen csökken. Szokásos emulgeátor hozzáadása növekedésgátláshoz vezet. Ez a nehézség úgy győzhető le, hogy a mikroorganizmusokat peptontartalmú ásványisó-médiumon hagyjuk nőni és amikor elérték a logaritmikus növekedés szakaszát, vizes emulziót adunk hozzá, melyet vizes koleszterin-szuszpenzió nedves őrlésével és hősterilizálásával állítunk elő. így sikerül a koleszterint 100%-ig kihasználni egynapos tenyésztési időn belül, és a kitermelés 1-2 g tiszta sejt-szárazanyag. Az emulziót olyan mennyiségben adjuk a tápfolyadékhoz, hogy a növekedés során literenként összesen 1— 20 g koleszterint adunk hozzá. A hozzáadást célszerűen részletekben végezzük el a mikroorganizmusok növekedésének az arányában. Kismennyiségű koleszterint előnyösen már a növekedés kezdetén, tehát a logaritmikus növekedési szakasz elérése előtt hozzáadunk a tápfolyadékhoz. Táptalajként 0,1-2 súly% peptont, 0,001-0,2 súly% K2 HP0 4 -et 0,05-1 súly% NH 4 H 2 P04-et, 0,05-0,1 súly% magnézium-szulfát-heptahidrátot, nyomnyi mennyiségű vaskloridot és kalcium-kloridot tartalmazó, 6-9 pH-jú vizes oldat vált be. A kezdeti koleszterin hozzáadás célszerűen 0,01-0,1%. 5 Ezzel a munkamódszerrel 7 egység specifikus koleszterinoxidáz-tartalom érhető el per gramm baktérium-szárazanyag és mintegy 1 -3,5 gramm baktérium-szárazanyagot kapunk per liter tápmédium. Lehetséges az említett mikroorganizmusok spe-10 cifikus koleszterinoxidáz-tartalmát többszörösére emelni és egyidejűleg a tápoldat 1 literére eső baktérium-szárazanyag mennyiségét megkétszerezni. Ez úgy érhető el, hogy olyan mikroorganizmust használunk, amelyet először acetáton és utána ko-15 leszterinen tenyésztünk mint egyedüli szénforráson. A szénforrásnak a táptalajban való egészen speciális — a fentiekben definiált— elosztásánál a mikroorganizmusok koleszterinoxidáz-tartalma erősen megnő és ebből kifolyólag még egyébként azonos 20 feltételek mellett is a mikroorganizmus-kitermelés lényegesen emelkedik, összehasonlítva a peptontápanyag használatával. így ha mikroorganizmusokat a fentiekben leírt összetételű ásványisó-médiumon tenyésztjük, de benne a peptont 25 0,5 súly% acetáttal helyettesítjük a koleszterinemulzió hozzáadásáig (amit az 1 :20 hígítású tápoldat kereken E = 0,25 értékű zavarósságánál kezdünk meg). 24 E/g szárazanyag fajlagos aktivitást érünk így el. Egyidejűleg azonban a szárazanyag-30 -tartalom is 6,5 g/liter-re emelkedik, tehát több mint 100%-kal nő. A szárazanyag-tartalom és aktivitás további jelentős fokozása érhető el, ha a fent leírt vizes 35 koleszterin-szuszpenzióhoz emulgeálószerként kismennyiségű, 0,02-1 súly% előnyösen 0,05-0,3 súly% élesztőkivonatot adunk. Kedvező eredményeket kapunk ammónium-acetát formájában jelenlevő 0,1— 2 súly% acetáttar-40 tatomnál. Más acetát, például kálium- vagy nátrium-acetát használatánál ekvimolekuláris mennyiséget alkalmazunk. A koleszterin főmennyiségét akkor adjuk a tápoldathoz, amikor a mikroorganizmusok elérik a 45 logaritmikus növekedés szakaszát, tehát amikor a gyorsuló növekedés szakasza a logaritmikus fázisba megy át. Ez összefüggésben van Monod definíciójával, mely szerint a mikroorganizmusok növekedési fázisainak sorrendje: kezdeti nyugvó szakasz, gyor-50 suló növekedés szakasza, logaritmikus növekedés szakasza és csökkenő szaporodás szakasza. A hozzáadás egy vagy több adagban, vagy pedig folyamatos adagolással történik. Különösen előnyös táptalaj ezért 0,1—2 súly% 55 acetát (ammónium-acetát formában), 0,01-0,2-súly% K2 HP0 4 -et, 0,05-1 súly% NH 4 H 2 P0 4 -et, 0,05-0,1 súly% magnézium-szulfát-heptahidrátot, nyomnyi mennyiségű vaskloridot és kalcium-kloridot tartalmazó, 6—9 pH-jú vizes oldat. A fent 60 meghatározott növekedési fázis elérésekor az acetátot koleszterinnel helyettesítjük. Mivel a pH-érték a tenyésztés folyamán emelkedne, folyamatosan vagy adagokban savat adunk a tápoldathoz, úgyhogy a pH közel állandó marad. Sav gyanánt ecet-65 savat használunk abban a növekedési fázisban, ahol 3
