169957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glikogénn-foszforiláz és izoenzimei kimutatására, illetve az izoenzimek szétválasztására vérszérumban
5 169957 6 A d) eljárásváltozatban említett glükóz-6-foszfát olyan különleges vegyület, amely a három izofoszforiláz izoenzim közül csak az izofoszforiláz I izoenzimet inhibitálja. A találmány szerinti eljárás alkalmas vizsgálati 5 módszerként a szívizominfarktus biztos diagnosztizálására. Egészséges személyek vérszérumában egyáltalán nem mérhető a glikogén-foszforiláz aktivitása. Ezen okból elméletileg infarktusgyanús személyek vérszérumában glikogén-foszforiláz bár- 10 mely jellegű kimutatása diagnosztikai jelentőséggel bír (ezt a kimutatást végezhetjük az a) vagy a b) eljárásváltozat szerint), míg a szívspecifikus izofoszforiláz I kimutatása a vérszérumban egyértelműen infarktusra utal (ez az izoenzim a c) vagy 15 d) eljárásváltozattal mutatható ki). A találmányt közelebbről az alábbi kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani. 1. példa 20 Glükogén-foszforiláz meghatározása A meghatározáshoz az alábbi összetételű oldatokat használjuk: 25 1. oldat: 0,1 m nátrium-fluorid (pro anal. minőségű, a VEB Berlin-Chemie cég gyártmánya), 0,001 m nátrium-0-glicerofoszfát, 30 pH 6,1, 0,015 m merkapto-etanol (a Ferak nyugat-berlini cég gyártmánya), 2. oldat: 0,4 m nátrium-0-glicerofoszfát, 35 pH 6,8, 0,001 m etiléndiamin-tetraecetsav (pro anal, minőségű, a VEB Berlin-Chemie cég gyártmánya), 0,015 m merkapto-etanol, 40 3. oldat: 0,04 m glicil-glicin, pH 6,8 (pro anal, minőségű, a VEB) Berlin-Chemie cég gyártmánya), 0,01 m merkapto-etanol, 45 0,008 m etiléndiamin-tetraecetsav, 4. oldat: 3,3% glikogén (az NSZK-beli Merck cég gyártmánya), 5. oldat: 0,083 mglükóz-1-foszfát (az NSZK-beli Boehringer cég gyártmánya, pro anal, minőségű), 0,005 m adenozin-monofoszfát (az NSZK-beli Boehringer cég gyártmánya, pro anal, minőségű). A vérszérumot membránszűrés útján (a memb- 60 ránszűrést az Amincon osterhout-i holland cég módszerével végezzük, amely abban áll, hogy a vérszérumot úgynevezett Centriflo-hüvelyeken át centrifugáljuk, az elválasztási határ ebben az esetben 20-50000-es molekulasúlynál van) 2:1-3:1 65 arányban koncentráljuk, vagy oldható keményítővel (pro .anal, minőségű, a Chemapol csehszlovák cég szállítja) előkezeljük. Az utóbbi esetben —4 C°-on 3—4 ml szérumot olyan 2 x 1 cm méretű keményítőoszlopra viszünk fel, amelyet előzetesen az 1. oldattal ekvilibráltunk. A keményítőoszlopot ez-, után háromszor 3—3 ml 1. oldattal mossuk, majd 30 C -on 2 ml 2. oldattal a glikogén-foszforilázt eluáljuk. A membránszűréssel koncentrált szérum egy térfogatrészét 1 térfogatrész 3. oldattal elegyítjük, ennek az elegynek 5 térfogatrészéhez vagy a keményítőoszlopon kapott eluátum 6 térfogatrészéhez 3 térfogatrész 4. oldatot és 2. térfogatrész 5. oldatot adunk. Az elegyet 37 C -on, 60 percen át végzett inkubálás után triklór-ecetsavval;denaturáljuk (a denaturáláshoz annyi triklór-ecetsavat használunk, hogy annak végkoncentrációja 5% legyen) és a reakciótermékként képződött foszfátot ismert módon meghatározzuk (lásd Weil-Malherbe, H. cikkét a „Handbuch der physiologisch- und pathologisch,-chemischen Analyse" című könyv III/1. kötetének 457-538. oldalán: a könyvet Hoppe-Seyler és Thierfelder szerkesztésében a Berlin-Göttingen-Heidelberg székhelyű Springer kiadóvállalat adta ki 1955-ben). A meghatározás alsó kimutatási határa 2 mU/ml szérum, ahol a „mU" egység egy nanomól/perc enzimatikus átalakulására, illetve percenként 1 nanomól ortofoszfát képződésére utal. 1.1 példa Glikogén-foszforiláz meghatározására szolgáló kompozíciót ismertetünk, amely a reakciótermékként képződő glükóz-1-foszfát meghatározásán alapszik. A meghatározást a foszfoglikomutáz és glükóz-6-foszfát-dihidrogenáz „segédenzim"-ek és niko tinamid-adenin-dinukleotidfoszfát jelenlétében kombinált enzimatikus és ultraibolyaspektroszkópiai módszerrel végezzük. A kompozíció egyes oldatainak összetétele az alábbi: 6. oldat: 0,3 m magnézium-acetát, pH 6,8. 7. oldat: 0,02 m adenozin-monofoszfát. 8. oldat: 0,04 m nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfát (oxidált), gyártja a VEB Arzneimittelwerk Dresden cég. 50 9.- oldat: foszfoglikomutáz (az NSZK-beli Boehringer cég terméke), 0,05 mólos nátrium-acetát-oldatban (pH 5,3), 1,1 mg fehérjét tárta maz ml-ként, 55 100 aktivitásegység/mg fehérje (Sephadex C 25 gyantán tisztítva). 10. oldat: glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz az (NSZK-beli Boehringer cég terméke) etiléndia min-tetraecetsavra vonatkoztatva 0,001 mólos és ammónium-hidroxidra vonatkoztatva 0,01 mólos oldatban (pH 9), 1,4 mg fehérjét tartalmaz ml-ként, 350 aktivitásegység/mg fehérje (Sephadex C 25 gyantán tisztítva). 3
