169957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glikogénn-foszforiláz és izoenzimei kimutatására, illetve az izoenzimek szétválasztására vérszérumban

169957 11. oldat: 0,5 m kálium-hidrogén-foszfát, pH 6,8 (pro anal, minőségű, a VEB Berlin-Chemie cég terméke). 12. oldat: 0,0004 m glükóz-1,6-difoszfát (az NSZK-beli Boehringer cég terméke). 1 -2 ml vérszérumot az 1. példában ismertetett módon keményítőoszlopra felviszünk, majd az oszlop 1. oldattal végzett mosása után 2 térfogatrész 2. oldatból és 1 térfogatrész 4. oldatból álló keverék 4 ml-jével eluálunk. Különleges optikai üvegből vagy kvarcból készült mérőküvettába bemérünk a fentiekben kapott eluátumból 2 ml-t, majd a küvettában az eluátumhoz 0,05 ml 6. oldatot, 0,18 ml 7. oldatot, 0,05ml 8. oldatot, 0,03 ml 9. oldatot, 0,02 ml 10. oldatot és 0,52 ml vizet adunk. A küvettát ezután 37 C°on 5-10 percen át inkubáljuk és az optikai sűrűséget erre a célra alkalmas berendezésben 340 nm-en meghatározzuk. A glikogén-foszforiláz aktivitásának kimutatására a küvettába még 0,15 ml 11. oldatot és 0,03 ml 12. oldatot adunk, majd a mérés kezdetétől számított 10-60 percben mérhető extinkciónövekedés alapján a képződött glükóz-1 --foszfát mennyiségét meghatározzuk, illetve a glikogén-foszforiláz aktivitását ismert módon kiszámítjuk (lásd Bergmeyer, H.U.: „Methoden der enzymetischen Analyse" című könyvét, amely az Akademie Verlag berlini kiadóvállalat gondozásában 1970-ben jelent meg). A példa szerinti meghatározás alsó kimutatási határa 0,2 mU/ml szérum. A 9. és 10. oldatoknál az „aktivitásegység" percenként egy mikromól glükóz-1-foszfát képződését, míg a „mU" rövidítés percenként 1 nanomól glükóz-1-foszfát képződését jelenti. 2. példa Izofoszforiláz I meghatározása Pontosan az 1. példában ismertetett módon járunk el, de az enzimaktivitás meghatározását az izofoszforiláz I enzimet gáltó glükóz-6-foszfátból 60 millimól jelenlétében végezzük, illetve az eluáláshoz 5 ml 2. oldatot és az eluátummal való elegyítéshez 5 ml 3. oldatot használunk. így ezáltal az 1. példában végzett meghatározás eredményétől való eltérés adja meg az izofoszforiláz I aktivitását. 3. példa Kompozíciót ismertetünk az izofoszforilázok egymástól való elválasztására és az enzirnaktivitás kimutatására, amely az alábbi összetételű oldatokból áll: 14. oldat: 0,03 m glűkóz-1 -foszfát, 0,002 m adenozin-monofoszfát 0,002 m riátrium-0--glicerofoszfát, 5 pH 6,8, 0,002 m etiléndiamin-tetraecetsav, 0,001 m merkapto-etanol 0,1 m nátrium-fluorid. 10 15. oldat: 0,01 mjód, 0,014 m kálium-jodid. 13. oldat: 0,042 0,001 0,049 m trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán, m etiléndiamin-tetraecetsav, m bórsav, pH 8,2. A keményítőoszlopon kapott glikozil-foszforiláz-tartalmú eluátum (lásd az 1. példát) a liquotjait (Az aliquotok térfogatát a várható enzimaktivitás figyelembevételével állapítjuk meg. Olyan nagyságú aliquotokból kell kiindulnunk, amelyek 0,1-4 mU glikozil-foszforilázt tartalmaznak.) 2:1 arányban 1,2 mólos szacharóz-oldattal hígítjuk és korongelektroforetikus technikával izofoszforilázokra szétválasztjuk. A szeparáláshoz használt gél [5% akrilamid, 0,2% N,N'-metil-bisz(akrilamid)] 0,1% glikogént tartalmaz és a 13. oldattal pufferolt, ugyanakkor a 13. oldat tölti be egyidejűleg az elektródapuffer feladatát. Az enzimhordozó géleknek a 14. számú oldatban végzett inkubálása után a gélbe bepolimerizálódott glikogénen képződött amilózszerű oldalláncokat a 15. oldattal láthatóvá tesszük, és a színintenzitásokból az egyes izoenzimek viszonylagos mennyiségére következtetünk. A kimutatás alsó érzékenységi határa 0,1 mU/ml szérum. Egy mU a jelen esetben a glikogénen percenként 1 nanomól glükozilcsoport oldallánc kialakulását jelenti. Egy konkrét esetben tehát úgy járunk el, hogy a beteg vérszérumából vett 2—4 ml térfogatú mintát előzetesen 4C -ra lehűtött, az 1. példában megadott minőségű keményítőből készült, 2 x 1 cm méretű oszlopra visszük fel (az oszlopot előzőleg az 1. példában említett 1. oldatból 20 ml-rel ekvilibráljuk), majd az oszlopot háromszor 3-3 ml 1. oldattal mossuk és 30 C -on az 1. példában említett 2. oldatból 1—2 ml-rel eluáljuk. Üvegcsövecskékben ezután a fent említett minőségű akrilamid•gél 70 x 3 mm nagyságú darabjaira a kapott eluátumból 0,1-0,1 ml-t rétegezünk. Ezután végrehajtjuk az elektroforézist 4C -on 2 órán át (az áramerősség gélenként 4 milliamper). Elektródapufferként a 13. oldatot használjuk. Ezután a gé-50 leket a fent említett 14. oldatból 5-5 ml-ben 37 C -on 16 órán át inkubáljuk, majd pedig a fenti 15. oldatból 5-5 ml-ben 20 percen át állni hagyjuk. A fölösleges jódot 5% ecetsavat és 5% metanolt tartalmazó vizes oldattal kimossuk. 55 Ha az előző bekezdésben ismertetett módon egy egészséges személytől vett vérszérumot kezelünk, akkor a kezelés végén a gélen elszíneződés nem észlelhető, vagyis a szérum nem tartalmaz glikogén-foszforilázt. (Ez a negatív eredmény megerősítheti, 60 illetve kiegészítheti az 1. példa szerint végzett gyors meghatározás eredményét, a körülbelül 1 órán belül végrehajtható 1. példa szerinti módszert - miként említettük — az izoenzimekre még szét nem választott glikogén-foszforiláz jelenlétének kimutatására 65 használjuk, míg az ebben a példában ismertetett 15 20 25 30 35 40 45 4