169957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glikogénn-foszforiláz és izoenzimei kimutatására, illetve az izoenzimek szétválasztására vérszérumban
169957 határozni a glikogén-foszforiláz összmennyiségét, valamint az összmennyiségen belül legalábbis félkvantitatíve az egyes izoenzimnek mennyiségét és kvantitatíve az izofoszforiláz I Tíiennyiségét. E feladatokat a találmány értelmében úgy old- 5 juk meg, hogy a) a glikogén-foszforiláz kvantitatív meghatározására a célszerűen önmagában ismert módon végzett membránszűréssel töményített, majd glicil-glicint, 10 merkapto-etanolt és etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldattal 1 :1 arányban kevert, vagy pedig nátrium-fluoridot, nátrium-0-glicerofoszfátot és merkapto-etanolt tartalmazó oldattal ekvilibrált keményítőoszlopra felvitel, azonos összetételű oldattal 15 végzett mosás és 6,8 pH-értéken és 30 C -on nátrium-0-glicerofoszfátot, merkapto-etanolt és etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldattal végzett eluálás útján előkezelt vérszérumot 5 : 3 arányban glikogéntartalmú oldattal összekeverünk, az így ka- 20 pott elegyhez 2 rész, glükóz-1 -foszfátot és adenozin-monofoszfátot tartalmazó oldatot adunk, a kapott elegyet 60 C -on inkubáljuk, majd triklór-ecetsavval denaturáljuk és végül vizes fázisban a 'foszfáttartalmat ismert módon a foszfomolibdát-komp- 25 lex redukciója útján optikai úton megállapítjuk, vagy b) a glikogén-foszforiláz kvantitatív meghatározására az a) változatban ismertetett módon elő- 30 kezelt vérszérumot foszfoglükomutáz és glükóz-6--foszfát-dehidrogenáz enzimek jelenlétében 6,8 pH-értéken adenozin-monofoszfátot, glikogént, kálium-hidrogén-foszfátot, glükóz-1,6-difoszfátot, magnézium-acetátot és nikotinamid-adenin-dinukleotid- 35 foszfátot tartalmazó oldatokkal elegyítjük és vizes fázisban a glükóz-1-foszfát tartalmat ismert módon ibolyántúli spektroszkópia útján meghatározzuk, vagy c) az egyes izoenzimek szétválasztására és fél- 40 kvantivatív meghatározására az a) változatban előkezelt vérszérumot 2 :1 arányban 1,2 mólos szacharóz-oldattal hígítjuk, a kapott elegyet 0,1% glikogént tartalmazó, továbbá trisz-(hidroxi-metil)-amino-metánt, etiléndiamin-tetraecetsavat és bór- 45 savat tartalmazó oldattal pufferolt, akrilamid alapú elválasztógélre felvisszük, azon önmagában ismert módon végzett korongelektroforézissel az izoenzimekre szétválasztjuk és végül glükóz-1-foszfátot, adenozin-monofoszfátot, nátrium-0-glicerofoszfátot, 50 etiléndiamin-tetraecetsavat, merkapto-etanolt és nátrium-fluoridot tartalmazó vizes oldatban végzett inkubálás után az elválasztógélt jód és kálium-jodid keverékével kezeljük, a jelentkező jód-jód-kálium-elszíneződést pedig optikai úton, célszerűen denzi- 55 tométerrel mérjük, vagy d) az izofoszforiláz I kvantitatív meghatározására az a) változatban ismertetett módon előkezelt vérszérumot 5:3 arányban glikogéntartálmú oldattal összkeverjük, az így kapott elegyhez 2 rész, glükóz-1-foszfátot, adenozin-monofoszfátot és glükóz-ó-foszfátot tartalmazó oldatot adunk, a kapott elegyet 60 C -on inkubáljuk, majd triklór-ecetsavval denaturáljuk és végül vizes fázisban a foszfáttartalmat ismert módon a foszfomolibdát-komplex redukciója útján optikai úton megállapítjuk, a kapott eredményt pedig az a) változatnál kapott eredményből levonjuk. A fenti a) eljárásváltozat foganatosítása során a keményítőoszlop ekvilibrálásához és mosásához 5,5-7,0 pH-értékű, 10~3 mól/liter -1 mól/liter nátrium-fluoridot, 10"4 mól/liter - 0,1 mól/liter nátrium-|3-glicerofoszfátot és 10 "4 mól/liter -0,1 mól/liter merkapto-etanolt tartalmazó vizes oldatot, eluáláshoz 6,0-7,5 pH-értékű, 10"4 mól/liter-0,1 mól/liter nátrium-|3-glicerofoszfátot, 10 ~4 mól/liter-1 mól/liter etiléndiamin-tetraecetsavat és 10 ~4 mól/liter-1 mól/liter merkaptoetanolt tartalmazó vizes oldatot adúsítással kapott szérummal való összekeveréshez 6-7,5 pH-értékű, 10 ~3 mól/liter glicil-glicint, 10 '4 mól/liter-0,1 mól/liter merkapto-etanolt és 10"4 mól/liter-1 mól/liter etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó vizes oldatot, az előkezelt szérummal való összekeveréshez pedig 0,1 g/liter-100 g/liter glikogént tartalmazó vizes oldatot, ületve 10 ~3 mól/liter-1 mól/liter glükóz-1--foszfátot és 10 "4 mól/liter-1 mól/liter adenozin-monofoszfátot tartalmazó vizes oldatot használunk. A fenti c) eljárásváltozat foganatosítása során az elválasztógél pufferolásához 7-9 pH-értékű, 10~4 mól/liter-1 mól/liter trisz-(hidroxi-metil)-amino-metánt, 10~4 mól/liter-1 mól/liter etiléndiamin-tetraecetsavat és 10"3 mól/liter-5 mól/liter bórsavat tartalmazó vizes oldatot, az inkubáláshoz 6-7,5 pH-értékű, 10"3 mól/liter-1 mól/liter glükóz-1-foszfátot, 10"4 mól/liter-0,1 mól/liter adenozin-monofoszfátot, 10"4 mól/liter-0,1 mól/liter nátrium-0-glicerofoszfátot, 10"4 mól/liter-1 mól/liter etiléndiamin-tetraecetsavat, 10"4 mól/liter-0,1 mól/liter merkaptoetanolt és 10"3 mól/liter-1 mól/liter nátrium-fluoridot tartalmazó vizes oldatot, valamint a jód-iód-kálium-elszíneződés megjelenítéséhez 10"4 mól/Íiter-0,05 mól/liter elemi jódot és 10"3 mól/liter-1 mól/liter kálium-jodidot tartalmazó vizes oldatot használunk. A c) eljárásváltozat, vagyis akrilamidgélen elektromos feszültség hatására történő szétválasztás után elkülönítve az egyes izoenzimeket megállapítható, hogy különböző ismert szubsztrátok átalakításánál az izofoszforiláz 1 és III izoenzimekre az úgynevezett k0>5 érték [azaz az a szubsztrátkoncentráció, amely a maximális szubsztrátátalakítás feléhez szükséges, a k0 ,s érték bizonyos körülmények között azonos az úgynevezett km -értékkel, azaz a Michaelis-Menten-konstanssal, bővebben lásd az Acta Biol. Med. German., 33, 149 (1974) irodalmi helyen] az alábbi: Glükóz-1-foszfát Ortofoszfát Glikogén Izofoszforiláz I 0,05 millimól 2,84 millimól 0,23% Izofoszforiláz III 6,9 millimól 7,14 millimól 0,91%
