169831. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penicillánsav előállítására benzil-penicillinből vagy fenoxi-metil penicillinből vízben oldhatatlan enzim komplexxel

11 169831 12 melyet a megfelelő pH-n végzünk, az enzim komplexet az 1. példa szerinti módon kezeljük. b) Ugyanannak a gyantának öt másik mintáját hasonló módon kezeljük, azzal az eltéréssel, hogy az adszorpciót 5,7—6,5 pH értéken végezzük. Az e kísérletben használt enzim-oldat térfogata 105 ml, az enzim aktivitás 54,7 [xM/perc/ml, 9,03 mg protein/ml, az oldat vezetőképessége 0,75 m/Ohm. Az eredményeket a III. táblázatban közöljük. Az eredmények azt mutatják, hogy az adszorpció optimális pH-ja 5,2—5,8. III. táblázat Példa pH Enzim komplex specifikus aktivitása nM/perc/g nedves súly 6 4,9 30,2 7 5,1 21,2 8 5,3 40,8 9 5,5 49,0 10 5,7 57,2 11 5,7 44,4 12 5,9 13,0 13 6,1 8,4 14 6,3 5,6 15 6,5 5,6 16—17. példa Ezek a példák azt szemléltetik, hogy az ugyanolyan minőségű, de eltérő szemcsenagyságú gyantákkal milyen eredményt lehet elérni. Az első kísérlethez az Amberlite IRC—50 típusú gyanta kromatográfiás változatát, vagyis az Amberlite CG—50 I típusú gyantát használtuk. Ennek szemcséi áthullanak a 100 ASTM jelű szitán, de fennmaradnak a 200 ASTM jelű szitán, tehát szemcsenagyságuk 0,074—0,149 mm. 15 g gyantára 6,3 pH-nál 3 órán át enzimet adszorbeáltatunk (200 ml, 23,7 [jiM/perc/ml, 3,86 jjiM/perc/mg protein). Az enzim komplexet elkülönítjük, 20 ml 0,825%-os glutáraldehiddel kezeljük 16 órán át, azután elkülönítjük és az 1. példában ismertetett módon mossuk. 21 g terméket kapunk, melynek aktivitása 114,5 \i M/perc/g nedves súly. Ezt a terméket a 2. példa szerinti termékkel hasonlítjuk össze, mely utóbbi előállításához olyan Amberlite IRC—50 típusú gyantát használtunk, mely a 14 ASTM jelű szitán áthullik, az 50 ASTM jelű szitán azonban fennmarad, tehát 0,297— 1,41 mm-es szemcsékből áll. Az összehasonlításból kitűnik, hogy kisebb szemcsékből álló gyantával jobb eredményt lehet elérni. A kísérletet megismételjük az Amberlite gyanta gyógyszerészeti változatával, vagyis az Amberlite IRP— 64 típusú gyantával. Ez áthullik a 100 ASTM jelű szitán, vagyis 0,037—0,149 mm-es szemcsékből áll. A gyantára 6,3 pH-nál enzimet adszorbeál tatunk (3920 fjiM/perc/g gyanta, 17,4 [i.M/perc/mg protein). Az enzim komplexet ezután 3,3%-os glutáraldehiddel reagáltatjuk és az 1. példa szerinti módon dolgozzuk fel tovább. A kapott enzim-gyanta komplex specifikus aktivitása 478,4 jj.M/perc/g nedves súly. 18. példa Amberlite IRC—50 típusú gyanta pH-ját 5,5-re állítjuk be hasonló pH-jú 0,2 mólos foszfátpufferrel való 5 mosással vagy desztillált vízben való szuszpendálással és nátriumhidroxid-oldatnak a szuszpénzióhoz való adagolásával. A gyantát a továbbiakban desztillált vízzel mossuk mindaddig, amíg a víz vezetőképességében nem tapasztalunk változást. 10 100 g nedves gyantát hozzáadunk 5,25 [xM/perc/mg protein aktivitású penicillin-aciláz 500 ml 0,02 mólos, 5,5 pH-jú foszfátpufferrel készített oldatához, és a rendszert 20 órán át keverjük szobahőmérsékleten. A szilárd anyagot kiszűrjük, 500 ml 0,25%-os glutár-15 aldehidben (foszfát oldatban) szuszpendáljuk, és további 20 órán át keverjük szobahőmérsékleten. A kapott enzim komplexet kiszűrjük és 7,8 pH-jú 0,2 mólos foszfátpufferrel mossuk, míg a gyanta kiegyenlítődik ezen a pH-értéken. 20 15 g így előállított enzim komplexet benzilpenicillin 0,2 mólos foszfátpufferrel 7,8 pH-ra beállított 200 ml térfogatú 6,25 %-os vizes oldatának hasítására használjuk. A reakciót 37 °C-on hajtjuk végre 2 óra alatt. Azt találtuk, hogy az enzim komplexet könnyen visszanyer-25 hetjük további felhasználásra, és hogy az enzim komplex mechanikai és biológiai stabilitását olyan jól megőrzi, hogy a komplexet legalább 25-ször fel lehet használni egymás után. 19. példa E példában az enzim komplexnek a 6-APA nagy 35 léptékben történő előállításánál való felhasználását, valamint a komplex ilyen körülmények között tapasztalható jó felhasználhatóságát szemléltetjük. Amberlite IRC—50 típusú gyanta felhasználásával 26,3 [j.M/perc/g aktivitású enzim komplexet készítünk. 40 A komplexet 40 liter benzilpenicillin oldathoz használjuk fel. Az oldat, melyet 0,02 mólos foszfátpufferrel készítünk, 6,5%-os. Az enzim komplexet drótháló segítségével visszatartjuk az edényben. így a reakció befejeződésekor a 6-APA oldatot kiszűrjük, a komplexet 45 vízzel mossuk, és elindítjuk a következő reakciót. Azt tapasztaltuk, hogy a 6 órás reakciókhoz 50-szer lehet felhasználni az enzim komplexet úgy, hogy a 6-APA konverziója 95% marad. 20. példa Ebben a példában az 1. példa szerinti eljárással Amberlite IRC—50 típusú gyantából készített enzim komp-55 lex mechanikai stabilitását hasonlítjuk össze egy olyan enzim komplex mechanikai stabilitásával, mely hasonló módon készült egy közepes aktivitású polimer, nevezetesen a XAD—7 típusú térhálós akrilészter polimer (forgalomba hozza a Rohm and Haas cég, USA) fel-60 használásával. Mindegyik enzim komplexből 1,6 kg-os mintákat szuszpendálunk 8 liter 0,2 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferban 37 °C-on, és a szuszpenziót 72 órán át keverjük percenként 200 fordulattal egy New Brunswick 65 Magnaferm típusú fermentáló készülékbén. 4 óránként 6