169831. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penicillánsav előállítására benzil-penicillinből vagy fenoxi-metil penicillinből vízben oldhatatlan enzim komplexxel
169831 hatatlan enzim komplexek legtöbbször mind mechanikai, mind biológiai szempontból elegendően stabilak, így azokat szakaszos reaktorban legalább 40-szer lehet használni penicillin-hasításra. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. A példákban olyan részlegesen tisztított aciláz enzimpreparátumot használunk, melyet az Escherichia coli NC1B 8734 aciláz-termelő törzs sejtjeiből mechanikai úton, homogenizáló berendezésben felszabadított acilázból készítettünk. A sejttörmeléket a pH 5,0 értékre való beállítása után szűréssel eltávolítottuk, és az enzim oldatát tovább tisztítottuk a kívánt specifikus aktivitás (1,5— 30 [xM/perc/mg protein) eléréséig. Az enzim oldatát azután — koncentrációjától függetlenül — addig dializáltuk, míg vezetőképessége mintegy 1 m/Ohm értékre csökkent. 10 15 a megfelelő pH-értékre beállított oldatában újra szuszpendáljuk. Az enzim specifikus aktivitása 3,85—6,75 (jiM/perc/mg protein, vezetőképességé 1 m/Ohm-nál kisebb. A gyantára kötött enzim mennyiségét 71 és 308 [xM/perc/g gyanta között változtatjuk. Az adszorpció közben a rendszert enyhén mozgatjuk, és a pH-t titrálószer adagolásával mindig a kívánt értéken tartjuk. 16 óra múlva a gyantát kiszűrjük, és glutáraldehid 0,825— 3,3%-os vizes oldatának 100 ml-ében újból szuszpendáljuk. Újabb 16 óra hosszat reagáltatjuk a gyantát a glutáraldehiddel, miközben a pH-t titrálószer adagolásával a kívánt értéken tartjuk. A kapott enzim-gyanta komplexet elkülönítjük, desztillált vízzel háromszor mossuk, azután vízben vagy 7,8 pH-jú 0,2 mólos foszfátpufferban szuszpendáljuk, a pH-t 7,8-re állítjuk be, és egy órán át 100 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú vizes karbamidoldattal kezeljük, majd desztillált vízzel háromszor mossuk. 1. példa Az alább említendő kereskedelmi kationcserélő vagy anioncserélő, gyanták 20, 25 vagy 50 g-nyi mennyiségét 100—500 ml desztillált vízben szuszpendáljuk. Kationcserélő gyanta esetén a pH-t 4,4 és 6,3 közötti értékre állítjuk be, anioncserélő gyanta esetén pedig 6,5 és 9,0 közötti értékre. Az előbbi esetben nátriumhidroxiddal, az utóbbi esetben sósavval végezzük a pH-beállítást, erőteljes keverés közben. A gyantát kiszűrjük, desztillált vízzel alaposan kimossuk, majd részlegesen tisztított penicillinaciláz 60—100, 250 vagy 500 ml térfogatú, 20 Minden így előállított enzim komplexet felhasználtunk a 6-APA benzilpenicillinből standard körülmények között, 7,8 pH-n és 37 °C-on való előállításában. Az enzim komplexek aktivitását az I. táblázatban közöljük. Az aktivitási adatok olyan komplexekre vonatkoznak, 25 amelyeket az enzim adszorpciója és a tartós enzimaktivitás szempontjából optimális pH-n készítettünk. A Bio-Rex és Chelex gyanták kereskedelmi termékek, a Bio-Rad Laboratories of California, USA-beli cég gyártmányai. A Lewatit gyantákat az NSZK-beli 30 Bayer A. G. cég, a Zeokarb és a Zerolit gyantákat a The Permutit Co., Ltd cég, míg az Amberlite gyantákat a Rohm and Haas (Philadelphia, USA) cég hozza forgalomba. /. táblázat A gyanta típusa és funkciós csoportjai A gyanta neve A gyanta fizikai állapota Az enzim-gyanta specifikus aktivitása optimális pH-nál Kísérlet A gyanta típusa és funkciós csoportjai A gyanta neve A gyanta fizikai állapota [xM/perc/g nedves súly (xM/perc/g száraz súly a sztirol-kvaterner Amberlite makroporózus 10,4 32,4 ammónium IRA—938 szilárd anyag b sztirol-kvaterner ammónium Amberlite IRA—401 gél : c akrilát-kvaterner ammónium Amberlite IRA—458 gél 4,71 10,1 d sztirol-poliamin Lewatit MP62 makroporózus szilárd anyag 15,1 30,7 e sztirol-poliamin Amberlite IR—45 gél 2,3 5,8 f akrilát-poliamin Amberlite IRA—68 gél — g sztirol—S03 H Lewatit SP120 makroporózus szilárd anyag 19,3 39,2 h sztirol—SO3H Lewatit S100 gél • i sztirol—SO3H Zerolit 325 gél j sztirol—SO3H Amberlite IR—120 gél ~
