169831. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penicillánsav előállítására benzil-penicillinből vagy fenoxi-metil penicillinből vízben oldhatatlan enzim komplexxel

5 169831 A 6-amino-penicillánsavat a találmány szerint oly módon állítjuk elő, hogy benzilpenicillint vagy fenoximetilpenicillint vagy a vegyületek valamely sóját vizes oldatban, 6,0 és 9,0 közötti pH-nál egy fent említett vízben oldhatatlan enzim komplexszel kezeljük. Az eljárásban bármilyen forrásból származó penicillin-aciláz-enzimet használhatunk. így abban az esetben, ha a 6-APA-t benzilpennicillinből állítjuk elő, baktériumokból, például Escherichia coli törzsből származó aciláz enzimet használunk, míg abban az esetben, ha a kiindulási anyag fenoximetilpenicillin, gombákból és Actinomycetes törzsekből származó aciláz enzimet használunk. Ezeket az Astra (Svédország), illetve a Bayer (NSZK) cég hozza forgalomba. A dezaciláz enzim aktivitását a szokásos módon azzal a 6-APA mennyiséggel mérik, melyet az enzim benzilpenicillinből képes termelni. így a leírásban említett enzimaktivitási adatok azt a 6-APA mennyiséget jelzik mikromólban ((JLM) kifejezve, amelyet 1 mg proteint tartalmazó enzim a benzilpenicillin 7,8 pH-jú oldatában 37 °C-on 1 perc alatt termel. Az enzim proteintartalmát Lowry standard módszerével határozzuk meg. A találmány szerinti eljárásban használt enzim komplexek aktivitását is hasonló módon határozzuk meg. Aktivitásnak azt a 6—APA mennyiséget tekintjük (fxM-ban), amelyet az enzim benzilpenicillin 7,8 pH-jú oldatából 37 °C-on 1 perc alatt termel, azzal az eltéréssel, hogy az enzim komplex egységnyi mennyisége ezúttal 1 g. Azt találtuk, hogy az adszorpciós kötési reakció kimenetelét és a kapott vízben oldhatatlan enzim komplex specifikus aktivitását kedvezően befolyásolja a kiindulási enzim tisztaságának növekedése. Ez az összefüggés azonban egy bizonyos tisztasági fok elérése után szembetűnően érvényét veszti, így az enzim tisztításának határozott gazdasági korlátja van. E megfigyelés alapján arra a megállapításra jutottunk, hogy az eljárás szempontjából kedvező tisztaságú enzim aktivitása 0,15—50 [xM/perc/mg protein, előnyösen 1,5—30 [xM/perc/mg/protein. Kívánt esetben az enzimet az adszorbeáltatás és kapcsolás előtt tisztíthatjuk. Az enzimet tisztíthatjuk oldatának rövid ideig, mintegy 30 percig tartó 50 °C-os hőkezelésével és/vagy ultraszűréssel. Más szokásos módszereket, igy a frakcionáls kicsapást vagy az ioncserélő cellulózzal vagy Sephadex-szel való kezelést is használhatjuk az enzim tisztítására. Az enzim hordozójaként metakrilsav polimert vagy metakrilsav kopolimert használunk. Ez szabad karbonsav-csoportokat tartalmaz, melyek a polimert savassá teszik. A makroporózus metakrilsav polimerek és kopolimerek előnyösebbek, mint a gél-alakú metakrilsav polimerek és kopolimerek. A metakrilsav polimereknek vízben oldhatatlannak kell lenniük, ezért térhálósított kopolimerek alakjában használjuk őket. Ilyen kopolimer a metakrilsav divinilbenzollal képzett kopolimerje vagy a glikol metakrilsavas diészteréből, például az etilénglikol-bisz-metakrilátból képzett kopolimer. Más ko-monomereket, így metakrilsav-észtereket is használhatunk a kopolimerek előállításához. A találmány előnye, hogy lehetővé teszi olyan polimer hordozók használatát, amelyek egyéb célokra már használatos kereskedelmi termékek. Ilyenek például a gyengén savas kationcserélő gyanták. Különösen alkalmasnak találtuk a metakrilsav-divinilbenzol kopolimert, amelyet Amberlite IRC—50 néven a Rohm and Haas (Philadelphia, USA) cég hoz forgalomba, Ugyancsak megfelelőnek találtuk azt a metakrilsav kopolimert, melyet korábban Zeokarb 227 néven a 5 Permutit Co, Ltd cég hozott forgalomba. Az utóbbi egy olyan divinilbenzol-metakrilsav kopolimer, mely benzolszulfonil-csoportokat is tartalmaz. A találmány szerinti eljárásban célszerűen olyan finom eloszlású, a 10 ASTM jelű szabványszitán áthulló, vagy-10 is 2,0 mm-nél kisebb átmérőjű szemcsékből vagy gyöngyökből áll. Az enzim komplexnek azonban nem szabad olyan finom eloszlásúnak lenni, hogy ne lehessen a reakcióelegyből egyszerű szűréssel eltávolítani, vagy oszlopos reaktorban használni. Ezért a polimer szemcse-15 nagyságának a 0,01 mm-t meg kell haladnia, vagyis a polimer szemcséknek fenn kell maradniuk a 800 ASTM jelű szabványszitán. A szemcseméretet az említett tartományon belül az aktuális reaktor-rendszertől függően választhatjuk meg. 20 A polimerrel érintkeztetett aciláz enzimnek vizes oldatban kell lennie, melyet az adszorpció előtt addig dializálunk, míg ionvezetőképessége a szokásos 5— 10 m/Ohm értékről 0,1—5 m/Ohm, előnyösen 1 m/Ohm értékre csökken. Az enzim oldatának pH-ja célszerűen 25 4,5—7,0. Az e tartományon belüli optimális pH értéket előzetes kísérletekkel kell megállapítani ahhoz, hogy maximális adszorpciót és tartós enzimaktivitást kapjunk. Ez az optimális pH érték általában 5,2 és 6,5 közé esik. A polimert kellő ideig, általában 2—16 órán 30 át kell érintkeztetni az enzim oldatával, hogy biztosítsuk az enzim maximális adszorpcióját. A hordozóra való adszorbeáltatás után az enzimet egy térhálósító szerrel, éspedig glutáraldehiddel, glioxállal vagy formaldehiddel in situ végzett kezeléssel köt-35 jük a hordozóra. Előnyösen glutáraldehidet vagy glioxált használunk. A glutáraldehiddel kötött enzim komplex különösen előnyös 6-APA előállítására. A térhálósító szert 0,1—15 súly%-os, előnyösen 0,5— 5,0 súly%-os vizes oldat alakjában használjuk. 40 A kötési reakció befejeződése után a reagálatlan térhálósító szert el kell távolítani vagy hatástalanítani kell. A fölösleges reagenst vízzel vagy egy aminovegyület, különösen karbamid oldatával való mosással távolíthatjuk el. 45 A 6-APA előállításában való felhasználás előtt az enzim komplex pH-ját gondosan be kell állítani. Ezt valamilyen lúgos kémhatású vegyülettel végezhetjük el a kötési reakció végén. A pH-t 6,0 és 9,0 közötti értékre, általában 7,0 és 8,5 közötti értékre, előnyösen 7,8-ra 50 állítjuk be. A találmány szerinti eljárás foganatosítása során az enzim komplexet benzilpenicillin vagy fenoximetilpenicillin vagy e vegyületek sójának vizes oldatával érintkeztetjük, mely oldat pH-ja a kívánt értékre van beállítva. A reakció hőmérsékletét 30 és 50 °C kö-55 zötti értéken, előnyösen 37 °C-on tartjuk. A reakció közben a benzilpenicillinből fenilecetsav, a fenoximetilpenicillinből fenoxiecetsav szabadul fel. Ezeket a savakat folyamatosan vagy szakaszosan semlegesítjük oly módon, hogy a reakcióelegypH-ját a kívánt tartományon 60 belül szabályozzuk. Mint fent említettük, a semlegesítéshez bármilyen lúgos kémhatású vegyületet használhatunk. A semlegesítést végezhetjük például nátriumhidroxiddal, azonban használhatunk illékony aminbázisokat.is, így ammóniát vagy trietilamint. 65 A találmány szerinti eljárásban használt vízben old-3