169794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiális lipáz előállítására
169794 11 12 A fent ismertetett kísérletek során kapott eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze. Amint a táblázat adataiból kitűnik, a találmány szerinti eljárással előállított lipáz enzim-aktivitása számottevő mértékben megnövekszik, epe jelenlétében. Ezzel szemben az ismert eljárással, Candida cylindracea által termelt kontrolllipáz (yö,; Agr, Eiol. Chem. 30, 11. sz., 1097, 1956) aktivitását epe jelenléte gátolja. Viszonylagos enzim-aktivitás Kutya-epe hígítást arány találmány szerinti lipáz (%) Candida cylindracea lipáz (%) 1: 50 133 33 1: 100 200 55 1:200 202 60 epe nélkül 100 100 E kísérletekben is gyógyszerkpnyvi minőségű olívaolajat alkalmaztunk szubsztrátumként, A találmány szerinti eljárással .előállított enzim 2,4 rész mennyiségét 24 tf.rész desztillált vízben oldjuk. Ezt az oldatot egy cellulózporral (a Toyo Roshi Co. Ltd. japán cég készítménye, 200^300 szitafinomságban; 0,02 mólos, 5,0 pH-értékű és 2.10-3 mól CaCl 2 -t tartalmazó acetát-puffer oldattal egyensúlyba hozva) töltött oszlopon, vezetjük keresztül. Az oszlopot azután ugyanilyen pufferoldattal eluálj,uk. ,és.. így 200 tf.rész eluátumot kapunk. Ehhez az eluátumhoz 50% (súly/tf) ammónium-szulfátot, adunk, a képződött csapadékot centrifugálással (9000 fordulat/perc, 10 percig) elkülönítjük, majd a fentivel egyező összetételű acetát-pufferoldattal szemben 72 óra.hosszat dializáljuk. A dializálás során kapott belső.pldatból 77 tf.rész mennyiséget egy dextránnal (a Pharmacia Co. Ltd. cég által gyártott, CarboxymethyJL-Sephadex C^50 készítmény, az említett, acetát-pufferoldattal egyensúlyba hozva) töltött oszlopon visszük keresztül az enzim adszorheáltatása, céljábóls Az oszlopot 0,1 mólos nátrium-klqrid-oldattal eluáljuk és így 23 tf.rész lipáz-frakciót kapunk. Ezt 4 °C hőmérsékleten éjjelen át állni,hagyjuk,,.amikoris 0,185 rész enzim válik ki kristályos alakban. Az így kapott enzim-termék fajlagos aktivitása 3750 E/mg. . E termék jellemző tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük: (A'} Szín: fehér (B') Jellemző elemi analízis: C: 47,05 ±0,05%; H: 6,48 ±0,02%; N: 13,99 ±0,01%. , (C) Jellemzp molekulasúly (Andrews szerint, Bio-chem. J. 91, 222, 1964, valamint S.D.S. poliakril-amid-gél elektroforézissel, J. Biol. Chem. 244, 5074, 1969): 26 000, ±1,000. ...,,. (D') Ibolyántúli abszorpciós színkép: Á 7. ábra szerint; maximális abszorppió 275— 280 millimikronnál, E^ő m[ji-,,l cm = 10,1. (É') Infravörös abszorpciós, színkép;, ,.,., A 8. ábra szerint (KBr korong-módszerrel)". szignifikáns infravörös (abszorpció-savók az alábbi csúcsértékeknél (mikronban): 3,00 (erős), 3.38 (közepes), 6,05 (széles, erős), 6,55 (széles, erős), 6,88 (gyenge), 7,15 (széles, közepes 8,12 (közepes) és 9,30 (széles, gyenge). (F'J Izoelektromos pont (elektro-fókuszálással): 5,8—6,7 pH. 5 (C) Oldhatóság: vízben és 0,01 —0,1 ion-erősségű vizes sóoldatokban.oldódik; alkoholban, acetonban és éterben oldhatatlan. (H') A pH-érték hatása az aktivitásra: 10 Az optimális pH-érték 5 és 8 között van, 37 °C hőmérsékleten 50 percig mérve, , gyógyszerkönyvi minőségű olívaolajjal, mint szubsztrátummal szemben. A mérési módszer azonos az ; egység fogalmának meghatározásával kapcsp-15 latban fentebb ismertetettel; a mérési eredrnéményeket a 9. ábra szemlélteti, ahol a szaggatott vonallal jelzett görbe a pol ivinilalkohol hozzáadása nélkül, a folytonos görbe a pplivin.il, alkohol hpzzáadásával kapott értékeket ábrá-20 zolja. (V) A hőmérséklet hatása az aktivitásra: Az optimális hőmérséklet .35—4 J, ?C„. 0.J mólos, 7,Q pH-értékűfoszfát-pufferpl(latban5Q perc: ;, ig mérve pjívaqlajjal (gyógyszerkönyvi minőség), 25 mint szubsztrátummal szemben. , A hőmérsékletnek, §z aktivitásra gyakorolt hatását ugyanolyan, módszerekkel njértük, mjnt az egyséig fogalmának fentebb ismertetett meghatározása .sprán; a mérési eredményeket a 10. 30 ábra szemlélteti. (J'J A pH-érték hatása a stabilitásra: 23 °C hőmérsékleten 2 órai állás, után, (különböző pH-értékeken) mértük a megmaradó lipázaktivitást (az eredeti aktivitás %-ában). A ka-35 pptt eredményeket a 11. ábra szemléllpti. Az enzim a 4—10 pH-tartományban stabilnak mutatkozott. (K'J Termostabilitás.: Az enzimet .oldatban, 7 pH-értéken, különböző 40 hőmérsékleteken 10 percig állni hagytuk;, a kapott eredményeket a 12. ábra szemlélteti. Az eredményekből .kitűnik, .hpgy az enzim 40 C hőmérsékletig stabil, 45 'C-on azonban már ,; 30%-ban inaktivájódik, 50 C-on pedig 90— 45 95? „-ban inaktiválódik. (V) Inhibitor hatása az aktivitásra: 0,05%, (súly/tf) lipázl és 5- 10~4 . mól, diizopropil-fluorofoszfátoi (DhP), etiléndiamin-letraecetsavat (EDTA) .illetőleg p-klórrmerkuriben-50 zoátot (PCMB) tartalmazó oldatban mértük a lipáz-aktivitást, 5 illetőleg 8 pH-értéken, 4 C hőmérsékleten történő 1 órai állás után. A kapott eredményeket az alábbi táblázat szemlélteti: Megmaradó aktivitás Reagens pH=5 pH = 8 DFR EDTA PCMB 100 (%) 100 100 95 100 (%) 100 94 95 6
