169794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiális lipáz előállítására
13 169794 14 Amint a fenti táblázat adatai mutatják, a találmány szerinti eljárással előállított lipáz stabil a fenti reagensek inhibitor-hatásával szemben. Ezért ez a lipáz nem tekinthető az úgynevezett fém-enzimek, SH-enzimek vagy szerin-enzimek kategóriáiba tartozónak. (M'J Az aminosav-elemzés jellemző adatai: 1. nem tartalmaz cisztein-csoportot; 2. két —S—S— kötést tartalmaz; 3. két triptofán-csoportot tartalmaz; 4. nem tartalmaz szacharidot; 5. nem tartalmaz lipoidot. (N'J Epe hatása az aktivitásra: Az olívaolajjal szembeni lipáz-aktivitás legalább 150%-kal megnövekszik (az eredeti aktivitáshoz viszonyítva), ha 1 : 200 arányban hígított kutya-epét adunk az enzimhez. Az ennek meghatározására végzett kísérleteket ugyanolyan módon folytattuk le, amint ezt fentebb az „(L) Az epe hatása az aktivitásra" címszó alatt ismertettük. Az eredményeket az alábbi táblázat szemlélteti: (H) 0,05% (súly/tf) lipázt és 5 • 10"4 mól diizopropil-fluor-foszfátot, etiléndiamin-tetraacetátot vagy p-klór-merkuribenzoátot tartalmazó oldatban stabil a fenti reagensek inhibitor-hatásával szemben, 5 (I) gyógyszerkönyvi minőségű olívaolajjal szemben mutatott aktivitása az eredeti aktivitás legalább 150%ára növekszik, ha 1: 200 arányban hígított kutya-epét adunk hozzá, a mérést 37 °C hőmérsékleten 0,1 mólos, 10 7 pH-értékű foszfát-pufferoldatban 50 percig végezve, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces nitens vagy Phycomyces blakesleeanus species-hez tartozó valamely lipáztermelő mikroorganizmust valamely táptalajban 15 °C és 45 °C közötti hőmérsékleten és 4—10 pH-érté-15 ken tenyésztünk, majd a képződött lipázt összegyűjtjük a táptalajban, és az összegyűjtött lipázt kinyerjük a táptalajból. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási mód-20 ja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces nitens species-hez tartozó mikroorganizmust alkalmazunk. Viszonylagos enzínl-aktivitás Kutya-epe hígítási arány találmány szerinti lipáz (%) Candida cylindracea lipáz (%) 1:50 1: 100 1: 200 epe nélkül 135 202 205 100 34 55 60 100 E kísérletekben is gyógyszerkönyvi minőségű olívaolajat alkalmaztunk szubsztrátumként. Ugyanilyen tisztított lipázt kapunk a fentebb felsorolt többi Phycomyces törzzsel. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces blakesleea-25 nus species-hez tartozó mikroorganizmust alkalmazunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces nitens IFO— 5694 törzset alkalmazzuk. 30 35 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces nitens IFO—5695 törzset alkalmazzuk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces nitens NRRL—2444 törzset alkalmazzuk. Szabadalmi igénypontok 40 1. Eljárás olyan mikrobiális lipáz előállítására, mely a következő tulajdonságokkal rendelkezik: (A) ultraibolya abszorpciós spektrumának maximuma 275—280 mjj, közé esik, (B) jellemző infravörös abszorpciós spektruma (KBr pasztillában felvéve, mfx-ben): 3,00 (erős), 3,38 (közepes), 6,05 (széles, erős), 6,55 (széles, erős), 6,88 (gyenge), 7,15 (széles, közepes), 8,12 (közepes), 9,30 (széles, gyenge), 50 (C) vízben és 0,01—0,1 ionerősségű vizes sóoldatokban oldódik, alkoholokban, acetonban és éterben oldhatatlan, (D) az aktivitása szempontjából optimális pH-érték 37 °C hőmérsékleten, gyógyszerkönyvi minőségű olíva- 55 olajjal, mint szubsztráttal szemben 50 percig mérve 5—8, (E) az aktivitása szempontjából optimális hőmérséklet 0,1 mólos, 7,0 pH-értékű foszfát-pufferoldatban, gyógyszerkönyvi minőségű olívaolajjal, mint szubszt- 60 ráttal szemben 35—41 °C, (F) 23 °C-on 4 és 10 pH-érték között stabil, (G) pH 7-nél 40 °C hőmérsékletig stabil, 45 °C-on 30%-ban inaktiválódik, 50.5C-on pedig 90—95%-ban inaktiválódik, 65 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces nitens NRRL—2678 törzset alkalmazzuk. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces blakes-45 leeanus IFO—5822 törzset alkalmazzuk. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces blakesleeanus IFO—5823 törzset alkalmazzuk. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces blakesleeanus IFO—5870 törzset alkalmazzuk. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Phycomyces blakesleeanus IFO—5871 törzset alkalmazzuk. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt 5,5 és 8 közötti pH-értéken folytatjuk le. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt 10— 240 óra hosszat folytatjuk. 7
