169794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiális lipáz előállítására

169794 9 10 inkubálási idő (óra): 18 30 42 54 66 a közeg pH-éf teke 6,2 6,4 7,0 7,2 7,5 lipáz-termelés (E/ml) 35 90 125 145 160 66 órai fermentáció után a fermentlét 5 °C körüli hőmérsékletre hűtjük és a sejteket szűrőprésen, diatómaföld szűrési segédanyag (Hyflo Super-cel) alkalmazásával kiszűrjük; ily módon körülbelül 80 000 tf.rész szűrletet kapunk. Ehhez a szűrlethez 50%-os koncentrációnak megfelelő mennyiségű ammónium-szulfátot adunk és a képződött csapadékot centrifugálással (9000 fordulat/perc, 10 percig) elkülönítjük. A kapott csapadékot hideg vízzel szemben dializáljuk a sók eltávolítása céljából, halbőr-membránnal, majd a kapott dializátumot liofilizáljuk. Ily módon 178 rész nyers, szürkésfehér színű enzimport kapunk, amelynek lipázaktivitása 55 E/mg. A fenti módon kapott 178 rész nyers enzimport 2000 tf.rész vizes 10%-os ammónium-szulfát-oldatban oldjuk, majd a kapott oldatot egy sztirol-típusú gyantát („Asmit 173 NP", az Imacti Co. holland cég készítménye) tartalmazó oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopon maradó enzimet 6000 tf.rész vizes 10%-os ammónium-szulfát-oldattal eluáljuk és az oszlopról távozó eluátumokat egyesítjük. Az így kapott oldathoz ammónium-szulfátot adunk 50% koncentrációnak megfelelő mennyiségben, majd a képződött csapadékot 5,0 pH-értékű, 0,02 mólos acetát-pufferoldattal szemben dializáljuk. A dialízis során kapott belső oldatot egy dietilaminoetil-cellulózt (a Serva Entwicklungslabor NSZK-beli cég készítménye, 5,0 pH-értékű, 0,02 mólos acetát-pufferoldattal egyensúlyba hozva) tartalmazó oszlopon vezetjük keresztül. A távozó folyadékhoz 60% koncentrációnak megfelelő mennyiségű ammónium-szulfátot adunk. Az így csapadékként kapott enzimfrakciót egy 2- 10-3 mól kalcium-kloridot tartalmazó, 5,0 pH-értékű, 0,02 mólos acetát-pufferoldattal szemben dializáljuk. A kapott dializátumot egy olyan oszlopra visszük, amely ugyanilyen pufferoldattal egyensúlyba hozott dextrán-gélt (Carboxymethyl-Sephadex C—50, a Pharmacia Co. által forgalomba hozott készítmény) tartalmaz. Az oszlopot azután 0,15 mólos nátrium-klorid-oldattal (ugyanilyen pufferoldattal készítve) eluáljuk; 600 tf.rész lipázban dús frakciót kapunk eluátumként. Ezt az eluátumot cellofán-membránon keresztül dializáljuk desztillált vízzel szemben a sók eltávolítása céljából, majd a kapott dializátumot liofilizáljuk. Ily módon 0,7 rész tisztított enzimet kapunk, amelynek fajlagos aktivitása 2400 E /mg. A fenti módon kapott enzim-termék az alábbi jellemző tulajdonságokat mutatja: (AJ Szín és alak: fehér, porszerű. (B) Jellemző elem-analízis: C: 46,12 ±0,25%; H: 6,51 ±0,07%; N: 13,80 ±0,20%. (C) Jellemző molekulasúly (Andrews szerint, Biochem. J. 91, 222, 1964): 25 000 ± 1000. (D) Ibolyántúli abszorpciós színkép: 1. ábra szerint; maximális abszorpció 275—280 millimikronnál, E^ mfx, 1 cm = 7,7. (EJ Infravörös abszorpciós színkép: 2. ábra szerint (KBr, korong-módszer); jellemző infravörös abszorpció mikronban az alábbi értékeknél: 3,00 (erős), 3,38 (közepes), 6,05 (szé-5 les, erős), 6,55 (széles, erős), 6,88 (gyenge), 7,15 (széles, közepes), 8,12 (közepes) és 9,30 (széles, gyenge). (F) Tzoelektromos pont (elektro-fókuszálással): pH 6,3 - 7,0. 10 (G) Oldhatóság: vízben és 0,01 — 0,1 ion-erősségű vizes sóoldatokban oldódik; alkoholokban, acetonban és éterben oldhatatlan. (H) A pH-érték hatása az aktivitásra: 15 az optimális pH-érték 37 °C hőmérsékleten, gyógyszerkönyvi minőségű olívaolajjal, mint szubsztrátummal szemben, 50 percig mérve: 5 és 8 között. A pH-értéknek az aktivitásra gyakorolt hatását ugyanolyan módon mértük, amint 20 ezt fentebb az egység (E) fogalmának meghatározása során leírtuk; a pH-értéknek az aktivitásra gyakorolt hatását grafikusan a 3. ábra szemlélteti, ahol a szaggatott vonallal jelzett görbe a polivinilalkohol hozzáadása nélkül, a 25 folytonos vonallal jelzett görbe a polivinilalkohol hozzáadásával kapott értékeket ábrázolja. (1) A hőmérséklet hatása az aktivitásra: optimális hőmérséklet 35—41 °C, 0,1 mólos, 7,0 pH-értékű foszfát-pufferoldatban, gyógyszer-30 könyvi minőségű olívaolajjal, mint szubsztrátummal szemben. A hőmérsékletnek a stabilitásra gyakorolt hatását ugyanolyan módon mértük, mint fentebb, az egység fogalmának a meghatározása során; a hőmérséklet e hatását gra-35 fikusan a 4. ábra mutatja. (JJ A pH-érték hatása a stabilitásra: 23 °C hőmérsékleten két órai állás után mértük a megmaradó lipáz-aktivitást különböző pH-értékeken. Az eredményeket grafikusan az 5. áb-40 ra szemlélteti. Az eredmények szerint az enzim stabilnak mutatkozott 4 és 10 pH-érték között. (K) Termostabilitás: Az enzimet 7 pH-értéken, 0,1 mólos foszfátpufferoldatban különböző hőmérsékleteken tar-45 tottuk 10 percig, majd mértük a megmaradó lipáz-aktivitást. Az eredményeket grafikusan a 6. ábra szemlélteti. Az enzim 40 °C hőmérsékletig stabil, 45 °C-on 30%-ban inaktiválódik, 50 °C hőmérsékleten pedig 90—95%-ban in-50 aktiválódik. (L) Az epe hatása az aktivitásra: Az olívaolajjal szembeni lipáz-aktivitás legalább 150%-kal megnövekszik (az eredeti aktivitás-55 hoz viszonyítva), ha 1: 200 arányban hígított kutya-epét adunk hozzá. Az ennek meghatározására végzett jellegzetes kísérleteket az alábbiakban ismertetjük. Az epét közvetlenül egy kan hibrid kutya epehólyagjá-60 ból vettük injekciós fecskendő segítségével, majd 1: 50, 1: 100 és 1: 200 arányban hígítottuk; ezeket a hígított oldatokat adtuk a lipáz-szubsztrátum rendszer megfelelő hányadrészéhez és öszszehasonlítottuk az enzim-aktivitásban bekövet-65 kező változásokat. 5