169758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás élő szarvasmarha adeno-vírustörzs és az élő vírust tartalmazó vakcina előállítására
7 169758 8 Az Eunice vírustörzs hőmérsékletérzékeny jellegének vizsgálata A vírus különböző hőmérsékleteken észlelhető növekedését titrálassal határozzuk meg. Az eredményeket az 1. táblázatban közöljük. A táblázat adatai szerint a letörési hőmérséklet 39,5 ±0,5 C°. összehasonlításként közöljük a WBR 1/7 alaptörzs megfelelő növekedési adatait is. Az adatok összehasonlításából kitűnik, hogy az Eunice törzs a 39,5 C°-os határhőmérsékleten már csak igen kismértékű szaporodásra képes, míg az alaptörzs reprodukciós képessége változatlan. 1. táblázat törzs Vírus-hozam (TCID50 ) log 10 /0,l ml egységekben 39,5 C-on és 35 C-on észtörzs 33 C°-on 39,5 C-on lelt adatok eltérése WBR 1/7 Eunice 6,5 4,5 6,5 1.7 0 2,8 Az Eunice törzs hőmérsékletérzékeny jellegének állandóságát in vitro körülmények között vizsgáljuk. Az Eunice törzset primer embrionális szarvasmarha vesesejttenyészeten (PFBK)megengedett hőmérsékleten (30— 35 C°-on), illetve meg nem engedett hőmérsékleten (39,5 C°-on) sorozattenyésztésnek vetjük alá. Az eredményeket a 2, táblázatban közöljük. A táblázat adataiból megállapítható, hogy a virus hőmérsékletérzékeny jellege 30—35 C°-on végzett 7 sorozattenyésztési lépés után is fennmarad, míg a törzs növekedése 39,5 C°-on végzett tenyésztés esetén nagymértékben visszaszorul. 2. táblázat Vírus-faktor TCID« logio/0,1 ml egységekben Lépés szama megengedett hőmérsékleten (30—35 C°) meg nem engedett hőmérsékleten (39,5 C°) 1 4 7 5 6,25 6,3 0,5 1,5 1,5 Megvizsgáltuk a meg nem engedett hőmérsékleten (39,5 C°-on) termelődött vírus hőmérsékletérzékeny jellegét is. Amint a 2. táblázat adataiból kitűnik, az Eunice törzs a meg nem engedett hőmérsékleten csak kismértékben növekedik. A 3. táblázat adatai azt igazolják, hogy a meg nem engedett hőmérsékleten fejlődött vírusok megtartják hőmérsékletérzékeny jellegüket. A 39,5 C°-oii termelődött vírusok faktora (TCID50 log10 /0,l ml egységekben) megengedett és meg nem engedett hőmérsékleten 3. táblázat Az indukálás hőmérséklete Faktor 35 C° 39,5 C° 3 ^0,5 2. példa Embrionális szarvasmarha-veséket aszeptikus körülmények között elkülönítünk, aprítunk, és foszfátpuffer-5 sóoldat (összetétele: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HP0 4 , 0,2 g KH 2 P0 4 , desztillált víz ad 800 ml) és 100 ml desztillált vízzel készített MgCl2 • 6H2 0 oldat keverékével, majd 0,1 g CaCl2 100 ml desztillált vízzel készített oldatával mossuk. A végső oldatot, amelynek 10 pH-ja 7,2 és 7,4 közötti érték, szűréssel sterilizáljuk, és 2,5 g/l koncentrációjú pufferolt nátriumkloridos tripszin-oldattal tripszinezzük. Az elegyet 10 percig 37 e'en keverjük. Ezután a folyadékot eltávolítjuk, és azonos térfogatú friss tripszin-oldattal helyettesítjük. A tripszi-15 nézést a szövet teljes kimerüléséig folytatjuk, eközben a folyadékban szuszpendált sejteket időről időre elkülönítjük. Végül a szuszpenziót 5 percig 1000 fordulat/ perc sebességgel centrifugáljuk, és a sejtüledéket növesztő táptalajban (10% vírusmentes borjúszérummal, 20 0,5% laktalbumin-hidrolizátummal, 0,1% élesztőkivonattal és 50 mcg/ml neomicin-szulfáttal kiegészített Hankféle alap-sóoldat) szuszpendáljuk. Körülbelül 200 000 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót készítünk. 1—1 ml így kapott sejtszuszpenziót 500 cm2 felületű 25 tenyésztőlombikokba töltünk, és 4—5 napig 37 C°-on inkubáljuk. E kezdeti inkubációs szakasz után a növesztő közeget eltávolítjuk, és a sejt-egyréteget a fenntartó közeggel kétszer mossuk. A fenntartó közeg Eagle-féle alap-sóoldat, amely adalékként 0,5% laktalbumin-hid-30 rolizátumot, 0,1% élesztőkivonatot, 0,1% triptóz-foszfát táptalajt és 50 mcg/ml neomicin-szulfátot tartalmaz. Az embrionális szarvasmarha vese-sejttenyészetet tartalmazó lombikokat 1—1 ml Eunice szarvasmarha Adeno 3 vírustörzs desztillált vizes szuszpenziójával 35 oltjuk be, A szuszpenzió koncentrációja körülbelül 2 X 106 TCID 50 /ml (azaz a többszörözési index 0,1). Minden lombikba a fenti mosófolyadékkal azonos öszszetételű fenntartó közeget töltünk, és a tenyészeteket nagymennyiségű vírus kialakulását lehetővé tevő ideig, 40 azaz, amint a szarvasmarha Adeno 3 vírus jellemző citopatogén hatásának vizsgálatával kimutattuk, legalább 5—10 napig 35 C°-on inkubáljuk. A felső folyadékfázisokat elkülönítjük, egyesítjük, és stabilizáló oldattal (összetétel: 60 g kaziton, 100 g sza-45 charóz, 75 ml 1/15 mólos dinátrium-hidrogénfoszfát oldat, 25 ml 1/15 mólos kálium-dihídrogénfoszfátoldat, 20 g monokálium-glutamát, desztillált víz ad 1 liter) 1: 2 térfogatarányban hígítjuk. A kapott készítményt 2 X 106 TCID 50 vírusegységet 50 vagy ennek többszörösét kitevő mennyiségben üvegfiolákba osztjuk szét, a fiolák tartalmát fagyasztva szárítjuk, és a fiolákat lezárjuk. Egyetlen dózist, illetve több dózist tartalmazó szárazampullás készítményeket kapunk. Felhasználáskor a szárazampullákhoz dózison-55 ként 4 ml vizet adunk, és orr-permetként, intranazálisan adjuk be az állatoknak. A vakcina jellemzői 60 a) Vakcinás kezelés A fenti módon kapott vakcinával intranazális úton 9 db hathónapos borjút oltunk be. Az állatoknak 2 X X 10 6 TCID 50 egység vírust adunk be (mindegyik orr-65 üregbe 2—2 ml vakcinát fecskendezünk). Az állatokat 4
