169501. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Nalfa-amino-védőcsoportok szelektív hasítására peptidek szintézisénél
3 169501 4 észter és terc-butiléter csoportok alkalmasak. To-. vábbá ezen „stabil'* védőcsoportok mellett a két lánc egyikének számára, például az inzulin A-láncához, egy szelektíven hasítható „labilis" a-amino-védö'csoport, és az első „labilis" amino-védőcsoport 5 mellett a két lánc másikának számára, például az inzulin B-láncához egy szelektíven hasítható második ,4abilis"_aminovédőcsoport szükséges. Ezek a különböző jellegű „labilis" a-amino-védőcsoportok azért szükségesek, mivel mindkét lánc felépítése 10 aminosavaknak vagy peptidfragmentumoknak a láncok aminovégeire történő ismételt kondenzálásával történik, a két láncnál külön-külön és az előbb szintetizált lánc viszonylag stabilabb a-amino-védőcsoportot igényel, mint az éppen felépítésben ievő 15 lánc. „Labilis" amino-védőcsoportként, például a Boc-csoporttal ellentétben, a fentiekben említett aralkiloxi-karbonil csoportok vagy tritilcsoport alkalmasak. Mindezideig azonban nem volt lehetőség, hogy a „labilis" amino-védőcsoportok két fajtája 20 egymás mellett szelektíven hasítható legyen. Találmányunk eljárás egyrészt tritilcsoport, másrészt ismert (A) általános képletű aralkiloxi-karbonilcsoport típusú — ahol 25 RÍ jelentése rövidszénláncú alkilcsoport, R2 jelentése rövidszénláncú alkilcsoport vagy fenilcsoport és R3 jelentése fenücsoport, •emellett a fenilcsoportok helyettesítetlenek vagy 30 rövidszénláncú alkilcsoporttal, rövidszénláncú alkoxicsoporttal, fenilcsoporttal, rövidszénláncú alkil-fenil-csoporttal vagy rövidszénláncú alkoxi-fenil-csoporttal helyettesítettek -35 N^-amino-védőcsoportok acidolitikus lehasítására peptidből, a találmány szerinti új eljárást az jellemzi, hogy egy peptidből, mely az említett védőcsoportok legalább egyikét tartalmazza, a lehasítást 2,2,2-trifluor-etanolban végezzük, emellett az NQ - 40 -tritilcsoportot 3—5, illetve az (A) általános képletű Na -aralkoxi-karbonilcsoportot 0—2 pH értéken hasítjuk le. A lehasításra abszolút, vagy vizes, például 0-30% víztartalmú 2,2,2-trifluor-etanolt használ- 45 hatunk. Előnyösen alkalmazhatunk 5—10% víztartalmú 2,2,2-trifluor-etanolt. A tritilcsoport ebben az oldószerben 3 és 5 közötti pH értéknél hasad le. Előnyösen pH 4 értéknél (amit a Fa.Metrohm AG, 50 Herisau. EA 147X típusú üvegelektródával mértünk), hasítható le, körülbelül 5—10 perc alatt. Ilyen feltételek között az aralkoxi-karbonilcsoport változatlan marad. Ez csak sokkal erősebben savas pH-nál (kb. 0-2 közötti) hasad le. Ez a tritil- és 55 aralkoxi-karbonilcsoport esetén kb. 1000 :1 arányú lehasadási sebesség aránynak felel meg. A pH-t szervetlen vagy szerves sav segítségével állíthatjuk be. így alkalmazhatunk egy ásványi savat, mint pl. egy halogén-hidrogénsavat, pl. fluorhidrogént vagy 60 előnyösen sósavat, vagy szerves savként például hangyasavat, ecetsavat, klór-ecetsavat vagy trifluor-écetsavat. A reakciót -50 C° és +65C°közötti hőmérsékleten végezzük, előnyösen szobahőmérsékleten dolgozunk. 65 Az (A) általános képletű aralkoxi-karbonilcsoportban a rövidszénláncú alkilcsoport előnyösen etil-, vagy különösen metilcsoport lehet, Rí és R2 előnyösen metilcsoport, R 3 fenil-, tolil- vagy p-bifenücsoport lehet. Az arálkiloxi-karbonilcsoport például az 1,1-difenil-etíloxi-karbonilcsoportot vagy mindenekelőtt a 2-fenil-izopropiloxi-karbonil- vagy 2-(p-tolil)-izopropiloxi-karbonil- vagy elsősorban a 2-(p-bifenüil)-2-izopropfloxi-karbonilcsoportot jelenti. Az aralkoxi-karbonilcsoportot, ha kívánatos, adott esetben trifluor-etanolban lehasíthatjuk. Ezt azonban ismert savas vizes közegben, például vizes hangyasavban, ecetsavban, vagy klór-ecetsavban vagy elegyekben, például ecetsav 8,28%-os hangyasav-víz (7:2:1) térfogat arányú elegyében, is lehasíthatjuk, v.o. a fent megadott irodalommal. A találmány szerinti eljárást a fent vázolt kettősláncú peptidek szintézisekor, például a következő módon végezhetjük: az oldalláncok aminocsoportjainak megvédésére Boc-csoportot alkalmazunk, és adott esetben, ha kívánt, a karboxil- és hidroxilcsoportok megvédésére terc-butilésztert és terc-butilétert alkalmazunk, az első lánc a-amino-csoportját (pl. az inzulin A lánca) Bpoc-csoporttal, a második lánc (B-lánc) a-amino-csoportját tritilcsoporttal védjük meg. A már megkötött két lánc részdarabján először a B láncot egészítjük ki, oly módon, hogy az aminocsoportot tartalmazó végen levő tritilcsoportot a találmány szerint lehasítjuk és a tritilcsoporttal védett aminosavakat illetve peptidegységeket rákondenzáljuk. A B lánc 1. számú aminosavát nemcsak tritilcsoporttal, hanem például a Boc-csoporttal is megvédhetjük. Ezután az A-láncból a Bpoc-csoportot lehasítjuk, például 80%-os vizes ecetsavval, és az aminovégre a megfelelő Bpoc-csoporttal védett aminosavat illetve peptidegységeket kondenzáljuk, amíg az A-láncot teljesen szintetizáljuk. Végül az oldallánc védőcsoportjait és a két a-amirío-védőcsoportot egy lépésben vagy kívánt esetben több lépésben lehasítjuk. Meg kell említenünk, hogy a három fajta, szelektív, savasán hasítható amino-védőcsoport nemcsak kettős láncú peptidek esetén szükséges. Ezek akkor is kívánatosak;, ha valamely egyláncú, több, nem azonos módon helyettesített oldallánc-aminocsoporttal rendelkező peptidet akarunk előállítani, például egy peptidet, amelyet az oldalánc a-aminocsoportján acilezett és amely egy további, azonban szabad oldallánc-aminocsoportot tartalmaz. Továbbá figyelembe kell venni, hogy a találmány szerinti eljárás nemcsak akkor alkalmazható, ha a szelektíven lehasítható amino-védőcsoport három fajtája szükséges. A többi ismert szelektíven hasítható amino-védőcsoportokhoz képest a tritil-és az említett aralkiloxi-karbonilcsoportok könnyebb és szelektívebb lehasíthátósága miatt előnyös érzékeny peptidek esetén a két védőcsóport alkalmazása, ennek során a tritilcsoportot „labilis", és az aralkoxi-karbonilcsoportot „stabil" amino-védőcsoportként alkalmazzuk. Kísérleteink során kitűnt, hogy az N-tritil- vagy az N-aralkiloxi-karbonilcsoport lehasítási eljárást 2,2,2-trifluor-etanolban megfelelő pH-nál (pH = 3-5, tritilcsoportnál különösen 4, arälkiloxi-karbonil-
