169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására
19 169402 20 4. példa Escherichia coli IFO-3450, Escherichia coli IFO-3470 vagy Escherichia coli var. communior IFO-3547 kétnapos, ferde tenyészetéből egy-egy 5 oltókacsnyi mennyiségű anyaggal beoltunk 200 ml-es rázólombikokba töltött 20-20 ml B jelzésű táptalajt, majd a lombikokat rázatás közben 24 órán át 24 C -on tartjuk. Az így kapott tenyészetekből a sejteket centrifugálás útján elkülö- 10 nítjük, majd 2,5 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferben (pH-ja 6,0) szuszpendáljuk. Ezekhez a szuszpenziókhoz hozzáadjuk 480 millimól PAG és 240 millimól 7-ADCA-metil-szulfonil-etilészter 2,5 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferrrel készült ol- 15 datát, majd a kapott reakcióelegyeket rázatás közben 16 órán át 37 C°on tartjuk. Ezután a reakcióelegyekhez 25 ml tetrahidrofuránt adunk a kapott termékek tökéletes felöl- 20 dására, majd a sejteket és egyéb oldhatatlan fehérjéket centrifugálás útján elkülönítjük. A kapott felülúszó folyadékfázisok polarimetriás vizsgálata alapján a terméklcént képződött 7-fenil-acetamido-3-dezacetoxi-cefalosporánsav-metil-szulfonil-etilész- 25 ter hozamát meghatározzuk. A kapott eredményeket az alábbi VIII. táblázatban adjuk meg: VIII. táblázat 30 A várt Mikroorganizmus termék hozama millimólban Escherichia coli IFO-3450 94,8 (79%)° Escherichia coli IFO-3470 99,6 (83%)' > Escherichia coli var. communior IFO-3547 82,8 (69%)1} ^ Az elméletileg kapható mennyiség százalékában 5. példa 45 Bacillus sp. (ATCC-14552) vagy Bacillus sp. (IFO-12063) kétnapos, ferde tenyészetéből egy-egy oltókacsnyi mennyiséggel beoltunk 200 ml térfogatú rázólombikokba töltött 20-20 ml Cjel- 50 zésű táptalajt, majd a lombikokat rázatás közben 24 órán át 28 C -on tartjuk. A kapott kétféle tenyészethez hozzáadjuk 160 mg TAG 2,5 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferrel készült oldatát (pH-ja 6,0), majd 114 mg 7-ADCA-metilészter 55 2,5 ml metanollal készült oldatát. A reakcióelegyeket ezután állandó keverés közben 16 órán át '37 C -on tartjuk. A reakcióelegyekben akkumulálódott 7-(2'-tienü-acetamido)-3-dezacetoxi-cefalosporánsav-metilészter mennyisége Bacillus sp. *° ATCC-14552 alkalmazása esetén 16,2 millimól, míg Bacillus sp. IFO-12063 alkalmazása esetén 15,8 millimól. A meghatározásokat spektrofotometriás úton 0-laktamáz alkalmazásával kombinálva végeztük. 65 6. példa Pseudomonas putida (IFO-3537) vagy Proteus rettgeri (ATCC-9250) kétnapos, ferde tenyészetéből egy-egy oldókacsnyi mennyiséggel beoltunk 200 ml térfogatú rázólombikokba töltött 40-40 ml C jelzésű táptalajt, majd a lombikokat rázatás közben 24 órán át 28 C -on tartjuk. Az így kapott sejteket centrifugálás útján elkülönítjük és 2 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferben (pH-ja 6,0) szuszpendáljuk. A szuszpenziókhoz hozzáadjuk 320 millimól PAG és 160 millimól 7-ADCA-metil-szulfonil-etilészter 2 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferrel készült oldatát, majd a reakcióelegyeket keverés közben 16 órán át 37 C°-on tartjuk. Ezt követően a reakcióelegyekhez 12 ml tetrahidrofuránt adunk, majd a sejteket és az oldhatatlan fehérjéket centrifugálás útján elkülönítjük. A kapott 75%-os vizes tetrahidrofurán-oldatokban a 7-fenil-acetamido-3-- d e z a ce t oxi-cefalosporánsav-metil-szulfonil-etilészter koncentrációját polarimetriásan határozzuk meg. A hozam 44 millimól Pseudomonas putida (IFO-3537) sejtjeit tartalmazó reakcióelegyben, illetve 36 millimól Proteus rettgeri (ATCC-9250) sejtjeit tartalmazó reakcióelegyben. 7. példa 160 millimól TAG-t és 80 millimól 7-ADCA-metilésztert tartalmazó, 20%-os vizes metanol-oldatból 10 ml-hez hozzáadjuk Escherichia coli (IFO-13502) 1. példában ismertetett módon tenyésztett, elkülönített, majd mosott sejtjeinek 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferrel (pH-ja 6,0) készített szuszpenzióját, majd a kapott elegyet keverés közben 3 órán át 30C°-on tartjuk. Ezt követően az elvégzett polarimetriás meghatározás szerint a reakcióelegy 28 millimól 7<2'-tienil-acetamido)-3-dezacetoxi-cefalosporánsav-metilésztert tartalmaz. A reakciót ezt követően diklór-metán és etiléter 1 :3 arányú elegyéből 50 ml beadagolása útján megszakítjuk, majd a reakcióelegyet alaposan rázzuk az előállítani kívánt termék tökéletes oldódásának biztosítására. A fenti oldószerelegyből újabb 50 ml felhasználásával az extrakciós műveletet még kétszer megismételjük, majd az extraktumokat egyesítjük és vízmentes nátrium-szulfát felett megszárítjuk. Ezután az oldószert 37C°-t meg nem haladó hőmérsékleten ledesztilláljuk, majd a kapott maradékot metanol és víz kis mennyiségű elegyéből kristályosítjuk. így 155 mg tűkristályt kapunk, amelyeknek olvadáspontja 196-198,C°. A termék optikai forgatóképessége [Ö]DS =+147C° (koncentráció 0,5%, oldószer metanol). Magmágneses rezonancia-spektrum (CDC13 ) 6 (p.p.m.): 2,07 (3H, szingulett), 3,25 (2H, kvard•ruplett), 3,75 (3H, szingulett), 3,77 (2H, szingulett), 4,87 (IH, dublett), 5,67 (IH, kvadruplett), 6,72 (IH, dublett), 6,90 (2H, dublett) és 7,17 (IH, triple«). A termék mágneses magrezonancia-spektruma és infravörös spektruma alapján azonosnak bizonyult egy hiteles mintával. 10
