169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására
21 169402 22 8. példa Escherichia coli (IFO-13502) az 1. példában ismertetett módon előálított tenyészetéből elkülönített és mosott sejtjeit olyan mennyiségben szusz- 5 pendáljuk. 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferben, hogy a kapott sejtszuszpenzióban a koncentráció négyszerese legyen az eredeti fermentlé sejtkoncentrációjának. Ehhez a szuszpenzióhoz hozzáadjuk 80 millimól 10 PAG és 67,4 millimól 7-ADCA-metilészter 10 ml 20%-os vizes metanol-oldattal készült oldatát, majd a kapott reakcióelegyet állandó keverés közben 4 órán át 37 C -on tartjuk. Ekkor a reakcióelegy a spektrofotometria és 0-laktamáz alkalmazásával vég- 15 zett kvantitatív meghatározás szerint 26,5 millimól 7-fenil-acetamido-3-dezacetoxi-cefalosporánsav-metilésztert tartalmaz (ez megfelel az elméletileg kapható mennyiség 79%-ának). A reakciót 4 órás reakcióidő után 40 ml tetra- 20 hidrofurán beadagolása útján megszakítjuk, majd a reakcióelegyet alaposan rázzuk. Ezt követően a sejteket és egyéb oldhatatlan anyagot centrifugálás útján elkülönítjük, és a kapott felülúszó folyadékfázist 37C°ot meg nem haladó hőmérsékleten és 25 csökkentett nyomáson betöményítjük. A képződött kristályokat kiszűrjük és metanolból átkristályosítjuk, így a 7-fenil-acetamido-3-dezacetoxi-cefalosporánsav-metilészter tűkristályait kapjuk, amelyek olvadáspontja 191-193 C°.o A termék optikai forga- 30 tóképessége [a]" =+23° (koncentráció 0,5%, oldószer metilén-klorid), míg E\% cm (260m//) = 185. A kapott terméket egy hiteles mintával infravörös és mágneses magrezonanciaspektroszkópiai adatai alapján azonosítottuk. 35 9. példa Escherichia coli (IFO-13502) 1. példában ismer- 40 tetett módon előálított tenyészetéből elkülönített és mosott sejteket 20 ml desztillált vízben olyan mennyiségben szuszpendálunk, hogy a kapott szuszpenzióban a sejtkoncentráció tízszerese legyen az eredeti fermentlé sejtkoncentrációjának. Ehhez a 45 szuszpenzióhoz hozzáadjuk 320 millimól TAG és 160 millimól 7-ACA-metoxi-metilészter 20 ml 20%-os vizes metanol-oldattal készült oldatát, majd a kapott reakcióelegyet 4 órán át 28 C -on tartjuk, miközben a reakcióelegy pH-értékét automatikus 50 pH-szabályzó berendezés segítségével 6,0 értéken tartjuk. A 4 órás reakcióidő után a reakcióelegy a spektrofotometria és (3-laktamáz alkalmazásával elvégzett kvantitatív meghatározás szerint 61 millimól 7-(2'-tienil-acetamido)-cefalosporánsav-metoxi-metil- 55 észtert tartalmaz. A reakcióelegyhez ekkor 120 ml tetrahidrofuránt adunk a képződött termék teljes feloldására, majd a sejteket és egyéb oldhatatlan anyagokat centrifugálás útján elkülönítjük. A kapott felülúszó fázist csökkentett nyomáson és 60 37 C -t meg nem haladó hőmérsékleten betöményítjük, majd a kiváló kristályos maradékot kiszűrjük, vízzel mossuk és metilén-kloridból, majd éterből átkristályosítjuk. így 203 mg 7-(2'-tienil-acetamido)-cefalosporánsav-metoxi-metilésztert kapunk, 6S amelynek olvadáspontja 158-159 C . A termék optikai forgatóképessége [a]" =+28C° (koncentráció 0,5%, oldószer metilén-klorid), Ej^m (260mu) = 162. A kapott terméket egy hiteles mintával mágneses magrezonanciaspektroszkópiai és infravörös spektruma alapján azonosítottuk. 10. példa Escherichia coli (IFO—3450) kétnapos, ferde tenyészetből egy-egy oltókacsnyi mennyiséggel 200 ml térfogatú rázólombikokba töltött 25-25 ml B jelzésű táptalajt beoltunk, majd a lombikokat rázatás közben 24 órán át 24 C -on tartjuk. Ezt követően a négy rázóiombikokból a fermentlét centrifugálás útján elkülönítjük, majd az így elkülönített sejteket 10 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferben (pH-ja 6,0) szuszpendáljuk. Ehhez a szuszpenzióhoz hozzáadjuk 160 millimól fenil-acetamid és 80 millimól 7-ADCA-metil-szulfonil-etilészter 10 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferrel készült oldatát, majd a kapott reakcióelegyet 16 órán át 37 C°-on tartjuk. Az így előállított 7 -f enil-acetamido- 3-dezacetoxi-cefalosporánsav-metil-szulfonil-etilészter hozama (a reakcióelegyben) 24,2 millimól. 11. példa Escherichia coli (IFO-13502) 1. példában ismertetett módon előállított tenyészetéből elkülönített, mosott sejteket 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferben (pH-ja 6,0) szuszpendáljuk olyan mennyiségben, hogy a kapott szuszpenzióban a sejtkoncentráció tízszerese legyen az eredeti fermentleben a sejtkoncentrációnak. A kapott szuszpenziöhoz 160 millimól TAG és 80 millimól 7-ACA-acetonüészter 10 ml 20%-os vizes metanol-oldattal készült oldatát adjuk, majd a kapott elegyet keverés közben négy órán át 30 C -on tartjuk. Ekkor a reakcióelegy 20,5 millirnólnyi mennyiségben tartalmaz terméket. Ezután a reakcióelegyhez 40 ml 'tetrahidrofuránt adunk, alaposan rázzuk, majd az elegyből a sejteket és egyéb oldhatatlan anyagokat centrifugálás útján elkülönítjük. A felülúszó folyadékfázist alacsony hőmérsékleten és csökkentett nyomáson betöményítjük, majd a képződött kristályokat kiszűrjük, és ezután metanol és éter elegyéből átkristályosítjuk. így 128 mg 7-(2'-tienil-acetamido)-cefalosporánsav-acetonilésztert kapunk. A terméket egy hiteles mintával mágneses magrezonanciaspektruma és infravörös spektruma alapján azonosítottuk. 12. példa Az 1. példában ismertettt módon előállított Escherichia coli (IFO-13502) tenyészetből elkülönített és mosott sejteket 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferben (pH-ja 6,0) olyan mennyiségben szuszpendáljuk, hogy a kapott szuszpenzió sejt-11
