169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására

7 169402 8 majd a kapott tenyészetet, vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyagot alkalmas körülmények között a II általános képletű szerves savak valamelyik említett hidrolizámató származékával és a III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsavészterekkel érintkeztetjük. Az említett tenyészet előállítására szolgáló módszer lehet levegőztetett, kevert tenyészet, rázott tenyészet vagy nyugvó tenyészet, de leginkább előnyösnek az aerób tenyészet bizonyult. Táptalajként bármely közismert, egy, vagy két vagy több tápanyagot, így például húskivonatot, élesztőkivonatot, peptont, kazein-hidrolizátumot, vagy kukoricalekvárt, továbbá kívánt esetben fenil-ecetsavat, szénvegyületeket (például cukrokat, szerves savakat vagy n-paraffinokat), különböző szerves és szervetlen nitrogéntartalmú anyagokat (például nitrogént aminők vagy nitrátok formájában tartalmazó vegyületeket), foszfátokat, magnéziumsókat, nátrium-kloridot és más fémionokat, valamint különböző vitaminokat tartalmazó táptalajt használhatunk. A táptalaj pH-értékét felhasználás előtt 6 és 9 közé beállítjuk. Az inkubálás hőmérsékletét célszerűen 20 C° és 37 C° között választjuk meg. Minthogy a tenyésztési idő az adott baktériumtörzstől és a tenyésztési körülményektől, közelebbről például a tenyésztésre szolgáló berendezéstől, a táptalaj összetételétől és az inkubálás hőmérsékletétől függ, kívánatos a tenyésztés befejezésének olyan időzítése, amikor az enzim-rendszernek a célvegyületeket termelő képessége maximális, vagyis a tenyésztést valahol a növekedés logaritmikus szakaszának második fele és a stacioner növekedési szakasz első fele között fejezzük be. Rendszerint 8 és 48 óra közötti tenyésztési idő bizonyult kívánatosnak. Az így kapott tenyészetet vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyagot használjuk az I általános képletű vegyületek előállítására szolgáló reakcióban. A fentiekben hasznát „a tenyészet feldolgozása útján kapott anyag" kifejezés alatt bármely és egyben az összes olyan. anyagot értjük, amely a tenyészet feldolgozása útján bármely formában kapható, és lehetővé teszi az I általános képletű célvegyületek előállítására nagyobb aktivitás kihasználását. így például, ha az I általános képletű vegyületek termelésében jelentkező aktivitás intracelluláris (sejten belüli) jellegű, akkor a „tenyészet feldolgozása útján kapott anyag" kifejezésen értjük többek között az 1. baktérium-tenyészetből elkülönített sejteket, 2. az említett aktivitást mutató, sejtektől mentes kivonatot, amely bizonyos ismert eljárásokkal a sejtekből előállítható, 3. az említett aktivitást mutató, részben vagy teljesen tisztított enzimet, amely ismert módon az előbb említett, sejtmentes kivonatból állítható elő, és 4. az említett aktivitást mutató, vízben nem oldódó enzimeket, amelyek úgy állíthatók elő, hogy az említett, részbea vagy teljesen tisztított enzimet fizikai vagy kémiai úton valamely vízben nem oldódó, nagy molekulasúlyú anyaghoz kötjük. Ha az I általános képletű vegyületek termelésében jelentkező aktivitás extracelluláris (sejten kívüli) jellegű, akkor a „tenyészet feldolgozása útján kapott anyag" kifejezésen értjük 5 1. azt a felülúszó folyadékfázist, amelyet a tenyészetből a sejtek elkülönítése útján kaptunk, 2. az említett aktivitást mutató, részben vagy teljesen tisztított enzimet, amelyet a fentiekben 10 említett felülúszó folyadékfázisból ismert módon különítettünk el, és 3. az említett aktivitást mutató, vízben nem oldható enzimeket, amelyeket az előző pontban említett módon elkülönített enzimek fizikai vagy 15 kémiai úton vízben nem oldódó, nagymolekulasúlyú hordozóanyaghoz; végzett „rögzítése" útján kaptuk. A II általános képletű vegyületek valamilyen 20 származékából és a III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsavészterekből az I általános képletű vegyületek előállítására szolgáló, a fentiekben ismertetett módon kapott tenyészetet, vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyagot haszno-25 sító eljárást a kondenzációs reakció végrehajtására rendszerint vizes közegben foganatosítjuk. A reakcióelegy pH-értékét a kondenzációs reakció során előnyösen pH 4 és pH 10 közé, különösen előnyösen pH 6 és pH 9 közé állítjuk be. Ha a tenyészet 30 vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyag vízoldható, akkor a kondenzációs reakciót oldatban foganatosítjuk, ha viszont a tenyészet vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyag vízben nem oldódik, akkor a kondenzációs reakciót vagy 35 szuszpenzióban vagy az alábbiakban ismertetett módon foganatosítjuk. A vízben nem oldódó, a kívánt aktivitást ugyanakkor mutató enzim valamilyen származékát egy kromatográfiás oszlopba töltjük, és ezen az oszlopon valamely II általános 40 képletű vegyület valamelyik említett hidrolizálható származékát és valamely III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsavésztert tartalmazó vizes oldatot bocsátunk át úgy, hogy a kondenzációs reakció az oszlopban végbemenjen. A kondenzációs 45 reakció bármely, a fentiekben ismertetett módon végzett foganatosítása esetén a reakció hozama növelhető, ha a reakciőelegyhez valamilyen, vízzel elegyedő szerves oldószert, így például valamilyen alkoholt, acetont vagy dimetil-szulfoxidot adunk. A 50 reakcióidő a szubsztrátumok koncentrációjától, az enzim aktivitásától, a reakcióhőmérséklettől és más tényezőktől függ, de előnyösen 1 perc és 30 óra között változik. A reakcióelegy hőmérsékletét a mintegy 0 C° és 55 mintegy 50 C közötti hőmérséklettartományban választjuk meg. A szubsztrátumok koncentrációját főleg a célterméket termelő enzim aktivitása alapján határozzuk meg. Általában a III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsavészterek koncentrá-60 cióját 0,1% és 20% között választjuk meg. Az I általános képletű termékeknek a III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsavészterekre vonatkoztatott hozamának növelése céljából a II 65 általános képletű savak koncentrációját előnyösen 4