169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására
169402 még az esetben sem, ha a szubsztrtátum koncentrációja több, mint 10%, sőt az enzimreakció könnyen végbemegy. Korábban említettük, hogy a penám-karbonsav-származékokat termelő enzimek általában egyide- 5 jűleg igen nagy mértékben elhidrolizálják a képződött penám-karbonsav-származékot. Ezért a képződött penám-karbonsav-származék hidrolízist szenved, ha a reakcióidő hosszú [Biochemical Journal, 115, 759-761, (1969)]. Másrészt a találmány sze- 10 rinti eljárásban képződött I általános képletű termék hidrolízise nem megy végbe teljes mértékben, és így az I általános képletű termék figyelemreméltóan magas hozammal, éspedig mintegy 70-80%-ban képződik. 15 Egy másik meglepő felismerésként kell megemlítenünk azt a kísérleti tapasztalatunkat, hogy valamely I általános képletű vegyületet nagy hozammal elő lehet állítani valamely III általános képletű vegyületből azt tízszer olyan nagy koncentrációban 20 alkalmazva, mint valamely Illa általános képletű vegyületet, ha az adott III általános képletű vegyület vízben nagy mértékben oldódik. Ezek a felismerések és a további kísérleteink 25 vezettek a találmány szerinti eljárás kidolgozásához. A találmány szerinti eljárás előnyei nyilvánvalóvá válnak, ha az eljárást összehasonlítjuk a fentiekben ismertetett, ugyanazon mikroorganizmus alkalmazásával az la általános képletű vegyületek előállí- 30 tására a II általános vegyületek valamelyik említett hidrolizálható származékából és a III általános képletű vegyületekből kiinduló eljárással. A találmány szerinti eljárás előnyei tehát többek között az alábbiak: 35 1. Az előállítani kívánt I általános képletű vegyületek termelési hozama figyelemreméltóan nagy. 2. A reagáltatás nagy koncentrációkban foganatosítható anélkül, hogy a reakció hozama csök- 40 kenne. 3. A II általános képletű vegyületek valamelyik említett hidrolizálható származékának az aránya jóval kisebb lehet, mint a fentiekben ismertetett, Illa általános képletű kiindulási vegyületeket alkal- 45 mázó eljárásban. 4. Minthogy az I általános képletű vegyület koncentrációja a reakcióelegyben nem csökken jelentős mértékben, ha a reakcióidő hosszú, a reakció végpontja nem lényeges. 50 A fentiekben említett előnyök mellett további előnyként jelentkezik, hogy az la általános képletű vegyületekkel ellentétben az I általános képletű vegyületek igen kis mértékben oldódnak vízbén, és 55 így szerves oldószerekkel végzett extrakció útján tisztíthatók. így az I általános képletű vegyületek előállíthatók olyan nagy tisztaságban is, ami lehetővé teszi felhasználásukat injekció formájában. Ez a találmány szerinti eljárás legnagyobb előnye az la 60 általános képletű vegyületek előállítására szolgáló eljárással szemben. * Az alábbiakban a találmány szerinti eljárásban hasznosítható törzsek kiválasztására mutatunk be egy módszert. 65 A vizsgált kísérleti baktériumot rázás közben tenyésztjük 20 C° és 40 C közötti hőmérséklettartományban alkalmas hőmérsékleten egy-két órán át. Miután megfelelő mértékű növekedés bekövetkezett, a baktériumsejteket elkülönítjük és a tenyészet térfogatával azonos térfogatú, 0,05 mólos citrát-foszfát pufferben (pH-értéke 6,0) szuszpendáljuk. A kapott szuszpenzióhoz 20 millimól 7-amino-cefalosporánsavat (a továbbiakban ezt a vegyületet „7-ACA" rövidítéssel jelöljük) és 60 millimól 2-tienil-acetil-glicint (a továbbiakban ezt a vegyületet „TAG" rövidítéssel jelöljük) adunk, majd a reakcióelegyet 30 percen át 37 C hőmérsékleten tartjuk. Azt a törzset, amely legalább 2 millimól 7-tienil-acetamido-cefalosporánsavat, cefalotint (a továbbiakban ezt a vegyületet „CET" rövidítéssel jelöljük) termel, a találmány szerinti eljárásban alkalmazható törzsnek tekinthetjük. A CET hozamát spektropolarimetriás úton állapítjuk meg..így az optikai forgatóképességben az 589 my-nál (10 cm, 27 C°, pH 6,0) mérhető változás (ARD) abban az esetben 0,540 értékű, ha 20 millimól 7-ACA 100%-os mértékben átalakul CET-té. A CET hozamát tehát úgy mérjük, hogy az említett összefüggést figyelembe véve a reakcióelegyet először 0 C -ra lehűtjük, majd a sejteket centrifugálás útján elkülönítjük, és a kapott felülúszó fázis optikai forgatóképességét 27 C -on a Perkin—Elme Amerikai Egyesült Államok-beli cég Model 14: elnevezésű digitális polariméterjével megmérjük. J reakció előtti forgatóképességtől (R§) való eltérés bői a CET hozama az alábbi egyenlet alapjai kiszámítható. a CET hozama = p30 pO Rr x 20 (millimól) A különböző törzsgyűjteményekben letétbe helyezett, a fentiekben ismertetett módszer alapján alkalmasnak bizonyult törzsek közül néhányat példaként az alábbiakban megemlítünk: Escherichia coli (IFO—3542), Escherichia coli (ATCC-9637), Escherichia coli var, communior 0FO-3547), Escherichia coli var. communior (IFO-3548), Bacillus sp. (ATCC-14552), Proteus rettgeri (ATCC-9250), Escherichia coli (IFO-13502 és ATCC-21985), Escherichia coli (IFO-3470 és ATCC-21986), Escherichia coli (IFO-3450 és ATCC-21987), Pseudomonas putida (IFO-3537 és ATCC-21988) és a Bacillus sp. (IFO-12063 és ATCC-21989). Az egyes mikroorganizmusok mögött zárójelben megadott számok az adott törzs letétbe helyezési számai, míg az IFO rövidítés az Institute for Fermentation törzsgyűjteményre (Osaka, Japán) és az ATCC rövidítés az American Type Culture Collection törzsgyűjteményre (Rockville, Maryland állam Amerikai Egyesült Államok) utal. Az I általános képletű vegyületek előállítása céljából az ezeket a vegyületeket termelni képes mikroorganizmust rendszerint először tenyésztjük, 3
