169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására

25 169402 26 előállítására, majd az így kapott enzimkészítményt használjuk a találmány szerinti I általános képletű 7 - (a -h elyettesített)-acetamido-cefem-4-karbonsavészterek előállítására. Számos ismert módszer alkalmazható az I általános képletű vegyületeket termelő enzimek megkötésére valamilyen, vízben oldhatatlan gyantához. Az alábbiakban azonban csak az úgynevezett azidos módszert ismertetjük, mint egy lehetőséget az alkalmazható, az enzim oldhatatlanságát biztosító módszerek közül. 400 ml metanolban 50 g karboxi-metil-cellulózt (Whatman CM—11 márkanevű anyagot) szuszpendálunk, majd miközben a szuszpenziót -10 C és —20 C közötti hőmérsékletre lehűtjük és cseppenként 100 ml tionil-kloridot adunk hozzá. A reakcióelegyet ezután jeges hűtés közben egy éjszakán át, majd szobahőmérsékleten három napon át állni hagyjuk. Az így képződött métilésztert ezután kiszűrjük, metanollal, acetonnal és éterrel mossuk, végül ezt követően megszárítjuk (hozam 41 g). Ezután a métilésztert 500 ml metanolban szuszpendáljuk, és a kapott szuszpenzióhoz 100 ml hidrazinhidrátot adunk. Az elegyet ezután visszafolyató hűtő alkalmazásával 65 C *-on három órán át forraljuk, majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A kapott CMC-hidrazidot metanollal, majd éterrel mossuk és megszárítjuk (hozam 39,3 g). Ezután 150 ml 2%-os sósavoldat és 30 ml 3%-os nátrium-nitrit-oldat elegyéhez 3 g CMC-hidrazidot adunk, és a kapott elegyet 30 percen át 4 C -on tartjuk. A képződött terméket kiszűrjük, és kétszer 200 ml hideg dioxánnal, majd 200 ml hideg vízzel mossuk. A kapott CMC-azidból 1 g-ot 5 ml 0,05 mólos foszfát-pufferben (pH-ja 8,) szuszpendálunk, és a kapott szuszpenzióhoz a 14. példában előállított enzim 10 ml 0,05 mólos foszfát-pufferrel készült oldatát hozzáadjuk. Ezután az elegyet egy éjszakán át 5 C -on tartjuk, majd a .képződött terméket kiszűrjük, és először 0,2 mólos vizes glicin-oldattal, majd 0,5 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal alaposan mossuk. Ezután meghatározzuk a kapott termék aktivitását. Megállapítottuk, hogy a vízben oldhatatlan készítmény előállításához használt enzim aktivitásának 12%-a jelentkezik a CMC-hez kötött készítmény aktivitásaként. Az így kapott, vízben oldhatatlan enzimkészítmény teljes mennyiségét 20 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferben (pH-ja 6,0) szuszpendáljuk, majd a kapott szuszpenzióhoz hozzáadjuk 160 millimól TAG és 80 millimól 7-ADCA-metil-szulfonil-etilészter 20 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferrel készült oldatát. A kapott reakcióelegyet 4 órán át 37 C -on tartjuk állandó keverés közben, amikor is a reakcióelegyben 28,2,mülimól 7-(2'-tienil-acetamido)-3--d e z a ce t oxi-cefalosporánsav-metil-szulfonil-etilészter akkumulálódik. A termék kvantitatív meghatározását polarimetriásan végeztük. 16. példa Escherichia coli (IFO-13502) 1. példában ismertetett módon előállított tenyészetéből elkülönített és mosott sejteket 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferben szuszpendálunk olyan mennyiségben, hogy a kapott sejtszuszpenzióban a sejtek koncentrációja az eredeti fermentlé sejtkoncentrációjának a tízszerese legyen, majd a sejtszuszpenzióhoz hozzáadjuk 160 millimól TAG és 80 millimól s 7-amino-3-(2"-piridil-tiometil)-3-cefem-4-karbonsav-metoxi-metilészter 10 ml 0,5 mólos citrát -foszfát --pufferrel készült oldatát. A kapott reakcióelegyet állandó keverés közben 4 órán át 37 C -on tartjuk, amikor is a reakcióelegyben a polarimetriás megha-J0 tarozás tanúsága szerint 24 millimól 7-(2'-tienil-acetamido)-3-(2"- piridil-tiometil)-3-cefem-4-karbonsav-metoxi-metilészter képződik. 15 17. példa Escherichia coli (IFÖ-13502) 1. példában ismertetett módon előállított tenyészetéből elkülönített és mosott sejteket 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-20 -pufferben szuszpendálunk olyan mennyiségben, hogy a kapott sejtszuszpenzióban a sejtkoncentráció tízszerese legyen az eredeti fermentlé sejtkoncentrációjának, majd a szuszpenzióhoz 160 millimól TAG és 80 millimól 7-amino-3-[6"-(3"-metoxi-piri-25 dazüiil)-tiometil]-4-metoxi-metoxi-karbonil-3-cefem-2"-oxid 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferrel készült oldatát adjuk. A kapott reakcióelegyet keverés közben 4 órán át 37 C -on tartjuk amikor is a reakcióelegyben a polarimetriás meghatározás tanú-39 sága szerint 22 millimól 7-(2'-tienil-acetamido)-3-[6"-(3"- metoxi-piridazinil)-tiometil]-4-metoxi-metoxi-karbonil-3-cefem-2"-oxid képződik és akkumulálódik. 18. példa Escherichia coli (IFO-Í3502) 1. példában ismertetett módon előálított tenyészetéből elkülö-40 nített és mosott sejteket 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferben szuszpendálunk olyan mennyiségben, hogy a kapott sejtszuszpenzió sejtkoncentrációja az eredeti fermentlé sejtkoncentrációjának a tízszerese legyen, majd a szuszpenzióhoz 160milli-45 mól TAG és 80 millimól 7-amino-3-[6"-(3"-metoxi-piridazinil)-tiometil]-4-metoxi-metoxi-karbonil-3--cefem-1 "-oxid 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferrel készült oldatát adjuk. A reakcióelegyet ezután keverés közben 4 órán át 37 C -on tartjuk, 50 amikor is a reakcióelegyben a polarimetriás kvantitatív meghatározás tanúsága szerint 27 millimól 7-(2'-tienil-acetamido)-3-[6"-(3"-metoxi-piridazinil)-tiometil]-4-metoxi-metoxi-karbonil-3-cefem-l"-oxid képződik és akkumulálódik. 19. példa Escherichia coli (IFO-13502) 1. példában ismer-60 tetett módon előállított tenyészetéből elkülönített és mosott sejteket 10 ml 0,5 mólos citrát-foszfát-pufferben szuszpendálunk olyan mennyiségben, hogy a kapott sejtszuszpénzióbaft a sejtkoncentráció az eredeti fermentlé sejtkoncentrációjának a 65 tízszerese legyen, majd a szuszpenzióhoz lóOmilli-13