169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására
169402 23 24 koncentrációja tízszerese legyen az eredetfl fermentlé sejtkoncentrációjának, majd a sejtszuszpenzióhoz 120millimól TAG és 60 millimól 7-ACA-difenil-metilészter 10 ml 20%-os vizes metanol-oldattal készült oldatát adjuk. A reakcióelegyet ez- 5 után keverés közben 4 órán át 30 C -on tartjuk. Ekkor a reakcióelegy 18,5millimólnyi mennyiségű terméket tartalmaz. A reakcióelegyhez 40 ml tetrahidrofuránt adunk, alaposan összerázzuk, majd a sejteket és egyéb oldhatatlan anyagokat centrifu- *0 gálás útján elkülönítjük. A felülúszó folyadékfázist alacsony hőmérsékleten és csökkentett nyomáson betöményítjük, majd a képződött kristályokat kiszűrjük és metanolból átkristályosítjuk. így 105 mg 7-(2 '-tienil-acetamido)-cefalosporánsav-difenil-metil- 15 észtert kapunk 61—63 C olvadásponttal, míg a termék optikai forgatóképessége [OÍ]QS = 0 C (koncentráció 0,5%, oldószer metilén-klorid). E}^m (260 mju)= 136. A terméket egy hiteles mintával mágneses magrezonanciaspektruma és infravörös 20 spektruma alapján azonosítottuk. 13. példa 25 480 millimól TAG-t és 240 millimól 7-ADCA-metil-szulfonil-etilésztert feloldunk 20 ml vízben, majd a kapott oldat pH-ját 6,0-ra beállítjuk. Eközben Escherichia coli (IFO-13502) 1. példában ismertetett módon előállított tenyészetéből elkülö- 30 nített és mosott sejteket szuszpendálunk 20 ml desztillált vízben olyan mennyiségben, hogy a kapott szuszpenzióban a sejtkoncentráció az eredeti fermentlé sejtkoncentrációjának a tízszerese legyen. Az így kapott szuszpenziót a fenti szuszpenzióhoz 35 hozzáadjuk, majd a kapott elegyet 37 C -on tartjuk, miközben pH-ját 2n sósavoldatnak automatikus pH-szabályozó berendezéssel végzett beadagolása útján 6,0 értéken tartjuk. A reakcióelegyben így 5 órán reakcióidő után 86,4 millimól termék akkumulálódik (a polarimetriás meghatározás tanúsága szerint). A reakciót ekkor megszakítjuk, és a reakció- 45 elegyhez a képződött termék feloldására 200 ml tetrahidrofuránt adunk. Ezt követően a reakcióelegyből a sejteket és egyéb okihatatlan anyagokat kiszűrjük, míg a szűrletet csökkentett nyomáson és 35C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten betörné- 50 nyitjuk, és a képződött kristályokat szűrés útján elkülönítjük. A kristályokat ezután metanol és éter elegyéből átkristályosítjuk, és így 1,26 g 7-(2'-tienil- a c e t a mi do)-3-dezacetoxi-cefalosporánsav-metil-szulfonil-etilésztert kapunk, amelynek az olvadáspontja 55 137-139C. A termék optikai forgatóképessége [a]o5 = +120° (koncentráció 0,5%, oldószer 75%-os vizes tetrahidrofurán-oldat). Ej^m (260 mju) = 175. Mágneses magrezonancia-spektrum (CDCl3 -ban felvéve)fJö [(p.p.m.) : 2,13 (3H, szignu- 60 lett), 2,94 (3H, szingulett), 3,33 (2H, dublett), 3,38 (2H, triplett), 3,83 (2H, szingulett), 4,65 (2H, kvadruplett), 4,95 (1H, dublett), 5,73 (1H, kvadruplett), 6,67 (1H, dublett), 6,98 (2H, dub. lett), és 7,25 (1H, triplett). 6S 14. példa Az 1. példában ismertetett módon Escherichia coli (IFO-13502) mikroorganizmust tenyésztünk, majd a tenyészetből a sejteket elkülönítjük, mossuk, és 2700 g így elkülönített sejtet (nedves súlyra számítva) 7 liter 0,1 mólos trisz-sósav-pufferben (pH-ja 8,0) szuszpendálunk. Ezután frakcionáló berendezést használva („Ribi" sejtfrakcionáló, RF-1 modell, gyártó cége: Sorval) a sejteket 1055 kg/cm2 nyomással elroncsoljuk. A kapott nyers extraktumhoz 17,3 g magnézium-szulfít-heptahidrátot (végső koncentrációja az elegyben 10 millimól) és 3,5 mg DNase—I márkanevű anyagot (gyártó cége: Sigma, végső koncentrációja az elegyben 0,5 g Mg/ml) adunk, majd az elegyet 5 C -on három órán át keverjük. Ezt követően az elegyhez por alakjában 282 g kalcium-acetát-monohidrátot adunk, majd feloldjuk az így beadagolt anyagot. Ezt követően még az elegyhez cseppenként fokozatosan 279 g kálium-hidrogén-foszfát 800 ml tiszta vízzel készült oldatát adjuk, hogy a nyers extraktumban kalcium-foszfát-gél képződjék, majd az egész rendszert azonnal centrifugáljuk. A kapott 7,9 liternyi felülúszó fázis pH-ját 10%-os ecetsavoldat adagolása útján 5,2-re beállítjuk, majd — miután a képződött csapadékot centrifugálás útján elkülönítettük - a pH-értéket 2%-os vizes ammónium-hidroxid-oldattal 7,5-re beállítjuk. Ekkor 60%-os telítődésig az oldathoz por alakjában ammónium-szulfátot adunk, a képződött csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük, majd kis mennyiségű tiszta vízben feloldjuk és tiszta vízzel szemben dializáljuk. A kapott 1,1 liternyi dializátumot dietil-amino-etil-cellulózzal töltött oszlopon (pH 8,5, 0,01 mólos trisz-puffer) bocsátjuk keresztül, majd a cefalosporinok szintézisére képes enzimet — amely adszorbeálódott -0,05 mól mennyiségben nátrium-kloridot tartalmazó, 0,01 mólos trisz-sósav-pufferrel (pH-ja 8,5) eluáljuk. Az aktív frakciókat összeöntjük, tiszta vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk, amikor is mintegy 730 mg súlyú enzimkészítményt kapunk. A találmány szerinti I általános képletű 7-(a-her lyettesített)-acetamido-cefem-4-karbonsavészterek a fenti enzimkészítménnyel például az alábbi módon állíthatók elő. 160 millimól TAG és 80 millimól 7-ADCA-metil-szulfonil-etilészter 20 ml vízzel készült oldatához (pH-ja 6,0) a fenti enzimkészítményből 20 rne-ot adunk, majd a kapott elegyet 4 órán át 37 C -on tartjuk, miközben a pH-ját 2n sósavoldat automatikus pH-szabályzóberendezéssel végzett beadagolása útján 6,0 értéken tartjuk. Polarimetriás kvantitatív meghatározás alapján ekkor (vagyis a 4 órás reakcióidő után) a reakcióelegy 58,2 millimól 7-(2'-tien il-a ce t a mi d o ) - 3 - dezacetoxi-cef alosporánsav-metil-szulfonil-etilésztert tartalmaz. 15. példa A 14. példában ismertetett módon előállított enzimet kémiai úton egy vízben oldhatatlan gyantához kötjük vízben oldhatatlan enzimkészítmény 12
