169364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az FR-02A antibiotikum előállítására
15 169364 16 hogy az antibiotikum a 3,5-4,0 KD -értéknek megfelelő tömeg-csúcsnál jelentkezik. Az említett KD -értékeknek megfelelő frakciókat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. Ily módon 16,4 mg FR-02A antibiotikumot kapunk, halványsárga szilárd termék alakjában. Az így kapott termék analitikailag tiszta és a szokásos kezelési és tárolási körülmények között jó stabilitást mutat. 2. példa Az FR—02A antibiotikum előállítása rázólombikos fermentációval, Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 mikroorganizmussal Első fokozatbeli inokulum-tápközeg: primer élesztő 1% desztillált vízben pH nátrium-hidroxiddal beállítva 7,0 Termelő tápközeg: kukoricalekvár 2,8 súly% déxtróz 5,6 súly% „Proflo" (Difco) 2,8 súly% glicerin l,4tf.% dimetil-formamid l,4tf.% vízvezetéki vízben pH nátrium-hidroxiddal beállítva 7,3 10 15 A fermentációhoz inokulumként a Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 törzs liofilizált kultúráját alkalmaztuk. Ezt a kultúrát egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba vittük be, amely 40 ml első 20 fokozatbeli inokulum-táptalajt tartalmazott, ennek összetétele: 25 30 A lombikot - valamint a következő második fokozatbeli inokulum-lombikot és a termelő fermentáció céljaira alkalmazott lombikot is - 28 C hőmérsékleten inkubáljuk, 220 percenkénti fordulattal működtetett forgó rázókészülékben. 35 Az első fokozatbeli inokulum-tápközeget két napig inkubáljuk a fent megadott körülmények között, majd 1 ml fenti módon kapott fermentációs terméket átoltunk egy másik Erlenmeyer-lombikba, amely 40 ml második fokozatbeli inokulum-tápta- 40 lajt tartalmaz, az alábbi összetételben: 45 Második fokozatbeli inokulum-tápközeg: „Ardamine YEP (99F) tápanyag 1% desztillált vízben pH nátrium-hidroxiddal beállítva 7,0 A második fokozatbeli inokulum-lombikot egy 50 napig inkubáljuk a fent megadott körülmények között, majd 1—1 ml inokulum-kultúrát átoltunk 10 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba, amelyek 40-40 ml termelő tápközeget tartalmaztak az alábbi összetételben: 55 60 65 A termelő fermentációs lombikokba az autoklávban történő kezelés előtt 1 csepp P—2000 habzásgátlót adtunk. 6,25 g Na2S 2 0 3 • 5H2 0 100 ml desztillált vízben történő oldása útján nátrium-tioszulfát-oldatot készítünk és ezt steril-szűrőn történő átszűréssel sterilizáljuk, majd ebből a steril nátrium-tioszulfát-oldatból 0,5 - 0,5 ml mennyiséget adagolunk minden egyes lombikba az autoklávban történő kezelés Után. Az így kapott, Összesen 400 ml steril tápközeget tartalmazó 10 termelő lombikot beoltás után 4 napig inkubáljuk 28 C° hőmérsékleten. A 10 termelő lombik tartalmát egyesítjük, a fermentációs termék pH-értékét sósav hozzáadása útján 5,5-re állítjuk, majd 500 ml kloroformot adunk a 400 ml fermentléhez és az elegyet szobahőmérsékleten 1/2 óra hosszat keverjük. Ezután a fázisok szétválasztása céljából centrifugáljuk és a vizes fázist elkülönítés után elvetjük. A kloroformos fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban elpárologtatjuk az oldószert. A maradékot 30 ml hexánnal rázzuk. A hexánt centrifugálás után dekantáljuk a maradékról. Ehhez a maradékhoz 30 ml vizet adunk, ammónium-hidroxiddal lOpH-értékre lúgosítjuk, majd az elegy pH-értékét a biológiai értékmérés céljaira 8,3-ra csökkentjük sósav hozzáadása útján. Az így kapott elegyet ugyancsak 8,3 pH-értékre állított vízzel hígítjuk és ezzel az oldattal végezzük a biológiai értékmérést az előzőkben már ismertetett módszerrel. A mérési eredmények azt mutatják, hogy a kapott fermentációs termék 320/ng/ml FR—02A antibiotikumot tartalmaz, ami az egész fermentációs termékre számítva 130 mg összhozamnak felel meg. 3. példa FR—02A antibiotikum termelése rázólombikos fermentációval, Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 törzzsel Ehhez a kísérlethez is a Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 törzs liofilizált kultúráját alkalmazzuk inokulumként. A liofilizált kultúrát 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokba adagoljuk, amelyek 40 ml első fokozatbeli inokulum-tápközeget tartalmaznak, e tápközeg összetétele: Első fokozatbeli inokulum-tápközeg: primer élesztő 1% desztillált vízben pH nátrium-hidroxiddal beállítva 7,0 Az első fokozatbeli inokulum-lombikot, valamint a következő termelési szakaszokban alkalmazott lombikokat is 28 C hőmérsékleten inkubáljuk, percenként 220 fordulattal működtetett forgó rázókészülékben. Az első fokozatbeli inokulum-kultúrát két napig inkubáljuk a fent megadott körülmények között, 8
