169364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az FR-02A antibiotikum előállítására
13 169364 14 A tíz lombikot azután 28 C° hőmérsékleten 4 napig inkubáljuk, majd az így kapott fermentlevet feldolgozzuk az antibiotikum kinyerése céljából. Az FR—02A antibiotikum kinyerése. 5 A fenti módon kapott összesen 400 ml fermentlé pH-értékét sósav hozzáadása útján 5-re állítjuk, majd kétszeres térfogatú kloroformot adunk hozzá. Alapos összekeverés után „Supercel" szűrőanyag-rétegen keresztül leszűrjük a folyadékot. A 10 szűrés meggyorsítása céljából elegendő mennyiségű vizet is adunk hozzá. A kapott szűrletet a kloroformos réteg elkülönüléséig állni hagyjuk. Ezután a kloroformos réteget elkülönítjük, 500-500 ml vízzel kétszer mossuk, vízmentes magnézium-szulfáttal 15 szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A kapott szilárd maradékhoz 500 ml petrolétert adunk, majd a szilárd részt szűréssel elkülönítjük, 50 ml petroléterrel mossuk, végül levegőn megszárítjuk. Ily módon 144 mg FR-02A antibiotikumot kapunk. 20 A fenti módon kapott FR-02A antibiotikumot ammóniumsóvá alakítjuk oly módon, hogy az FR-02A antibiotikumot 50 ml vízben oldjuk és az oldat pH-értékét ammónium-hidroxiddal 10-re állítjuk, majd ezt a meglúgosított oldatot liofilizáljuk. 25 így 140 mg FR-02A ammóniumsót kapunk. Minthogy az FR-02A antibiotikum a micéliumban és a szuszpendált tápanyagban is megtalálható, eljárhatunk oly módon is, hogy a micéliumot és a szuszpendált tápanyagot először szűréssel elkülö- 30 rútjuk a fermentléből, majd a szűrőn maradt szilárd anyagból az FR-02A antibiotikumot valamely vízzel elegyedő poláris szerves oldószerrel, például acetonnal extraháljuk. Ennek a módszernek a gyakorlati kivitele a következőképpen történhet: 35 A fentebb leírt fermentáció során kapott és egyesített 400 ml fermentációs terméket leszűrjük a micélium és a szuszpendált szilárd tápanyag elkülönítése céljából. A szűrőn maradt lepényt 40 ml 40 acetonnal 30 percig keverjük, majd újból leszűrjük. A szűrőn maradt lepényt 15 ml acetonnal mossuk és ezt a mosófolyadékot hozzáadjuk az előző szűréskor kapott acetonos szűrlethez. Az egyesített acetonos oldatot vákuumban, 30 C hőmérsékleten 45 bepároljuk az aceton eltávolítása céljából. A maradékot 15 ml vízben oldjuk és a vizes oldat pH-értékét sósavval 4,0-re állítjuk be. Ezután egyenlő térfogatú hexánt adunk hozzá és 10 percig keverjük. Leülepedés után a hexánt 50 dekantáljuk és kiselejtezzük. Még kétszer extraháljuk a vizes fázist a leírt módon, egyenlő térfogatú hexánnal, az utolsó hexános kivonat már színtelen. A vizes zagyot azután egyenlő térfogatú kloro- 55 formmal extraháljuk. Ugyanilyen térfogatú kloroformmal azután még egyszer extrahálunk és a két kloroformos kivonatot egyesítjük, a vizes fázist pedig elvetjük. Az így kapott kloroformos oldatot vízmentes 60 nátrium-szulfáttal szárítjuk, leszűrjük és a szűrletet vákuumban bepároljuk. Maradékként 106 mg FR—02A antibiotikumot kapunk. A kapott FR-02A antibiotikum (a fermentációs eljárással kapott termék) molekulasúlya „Sephadex 65 LH-20" adszorbenssel végzett kromatográfiával meghatározva körülbelül 1 000. A fenti módon kapott nyers terméket azután „Amberlite XAD-2" adszorbensen újból kromatografáljuk és így analitikailag tiszta terméket kapunk. Ezeket a kromatográfiai müveleteket az , alábbiakban részletesebben ismertetett módon végezzük: Kromatográfia „Sephadex LH-20" gélen 0,5 ml metanolos oldatot, amely 106 mg FR--02A antibiotikumot tartalmaz (az 1. példa szerinti eljárás termékét) ráviszünk egy 75 ml „Sephadex LH-20" gélt metanolban tartalmazó, 1,25 cm átmérőjű és 56 cm magasságú adszorbens-ágyra (e kísérletben a Pharmacia Fine Chemicals Inc., Piscataway, New Jersey, cég által gyártott adszorbenst alkalmaztunk). Az eluálást metanollal végezzük, az eluátumot „Meeco" gyártmányú differenciális refraktométerrel vizsgáltuk és ennek során három tömeg-csúcsértéket regisztráltunk. A kapott frakciókat biológiai értékméréssel vizsgáltuk 1—10-szeres hígításban, az ismert ágár-diffúziós módszerrel, Vibrio percolans organizmussal beoltott ágár-lemezeken 1,25 cm átmérőjű papír-korongok alkalmazásával. A fent említett harmadik tömegcsúcsnak (KD = 0,3) megfelelő gátlási zónákat kaptunk. Az említett harmadik tömeg-csúcsnak megfelelő frakciókat egyesítjük és bepároljuk, maradékként 43 mg FR-02A antibiotikumot kaptunk. Az így kapott terméket azután ismét ágár-diffúziós biológiai értékméréssel vizsgáltuk, Vibrio percolans organizmus alkalmazásával. 200 Mg/ml koncentrációval 16 mm átmérőjű gátlási zónát kaptunk. A termék ibolyántúli adszorbciós színképe pH = 7,0 foszfát-pufferoldatban az alábbi maximumokat mutatta: Xmax 327nmE 1 1 * m = 216, Xmax 232 nm Elírt =464. A „Sephadex LH—20" gélen történő tisztítás mellőzhető, ha az 1. példa szerint kapott terméket 9pH-értéknél vízben oldjuk (apH-értéket híg vizes nátrium-hidroxid-oldattal állítjuk be), majd az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából leszűrjük az oldatot és a szűrletet liofilizáljuk. Kromatografálás „Amberlite XAD-2" gyantán 43 mg fenti módon tisztított terméket további tisztítás céljából ráviszünk egy 150 ml „Amberlite XAD-2" gyantát (a Rohm et Haas Co., Philadelphia, cég gyártmánya) 50% izopiopanol-víz-elegyben tartalmazó adszorbens-ágyra (átmérő: 1,25 cm, magasság: 112 cm). Az anyagot 2pH-értékre savanyítjuk, hogy szabad savvá alakítsuk és ebben az állapotban visszük fel az oszlopba. Az eluátumot „Meeco" differenciális refraktométerrel vizsgáljuk, a regisztrált adatok két tömeg-csúcsot mutatnak. A szokásos ágár-diffúziós módszerrel (Vibrio percolans mikroorganizmussal, 0,8 cm átmérőjű papír-korongokkal) végzett biológiai értékmérés azt mutatta, 7
