169364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az FR-02A antibiotikum előállítására

7 169364 8 A fermentációt körülbelül 20 C° és 37 C° közötti hőmérsékleten folytatjuk le, optimális eredmények elérése érdekében azonban előnyös a 24 C° és 32 C közötti hőmérséklet-tartományban dolgozni. A Streptomyces lactamdurans mikroorganizmus tenyésztésére és az FR—02A antibiotikum termelésére alkalmas tápközegek pH-értéke előnyösen körülbelül 6,0 és 8,0 között lehet. Az FR-02A antibiotikum termelésére kis méretekben lefolytatott fermentációt előnyösen úgy végezzük, hogy a lombikban elhelyezett tápközeget beoltjuk az antibiotikumot termelő kultúrával, majd az így kapott inokulumot átvisszük a termelő tápközegbe és 28 C° körüli állandó hőmérsékleten néhány napig folytatjuk a fermentációt erre' alkalmas rázókészülékben. Az inkubációs időszak befejeztével a micéliumot és a szuszpendált tápanyagot centrifugálással vagy szűréssel elkülöníthetjük és külön extrahálhatjuk az oldószerrel, vagy pedig az egész fermentlevet extrahálhatjuk kloroformmal vagy valamely más vízzel nem elegyedő oldószerrel, eljárhatunk azonban oly módon is, hogy a fermentlevet a micéliumból és eseteg szuszpendált tápanyagból álló szilárd rész elkülönítése után extraháljuk a vízzel nem elegyedő oldószerrel. A kisméretű fermentációt sterilizált lombikban folytatjuk le, egy, két, három vagy négy fokozatban tenyésztett inokulummal. Az inokulum tenyésztése céljaira alkalmazott tápközeg bármilyen asszimilálható szénfonás és nitrogénforrás kombinációiát tartalmazhatja. Az inokulum-lombikot 28 C körüli állandó hőmérsékletű kamrában rázatjuk egy vagy két napig, az így kapott kultúrát azután vagy a következő inokulum-fokozatba, vagy a termelő tápközegbe oltjuk át. Az esetleg alkalmazott közbenső inokulum-fokozatokban a fent leírthoz lényegileg hasonló módon dolgozunk. A beoltott lombikokat állandó hőmérsékleten rázatjuk néhány napig a termelőkultúrában, ennek az inkubációs szakasznak a befejeztével a termelt FR-02A antibiotikumot a már fentebb leírt módon különítjük el és nyerjük ki a kapott fermentléből. Az FR—02A antibiotikum nagy méretekben történő termelése esetén a fermentációt célszerűen erre alkalmas tartányokban folytatjuk le, a fermentációs közeg keverésére és szellőzésére szolgáló berendezések alkalmazásával. Ebben az esetben a tápközeget magában a tartányban állítjuk elő és 120 C° körüli hőmérsékletre történő melegítés útján sterilizáljuk. Lehűlés uián a sterilizált közeget beoltjuk az előzetesen tenyésztett inokulum-kultúrával, majd az így elkészített termelő kultúrával a fermentációt néhány, például 2-4 napig folytatjuk, a tápközeg keverése és/vagy levegőztetése közben, 28 C körül tartott állandó hőmérsékleten. Az FR-02A antibiotikum hozama a fermentlé 1 literjére számítva - biológiai értékméréssel meghatározva - általában 20 mg és 200 mg között van. A biológiai értékmérést a következő eljárással végezzük: Difco-féle ágáros tápközeggel, lemezenként 10 ml 2,0 g/liter koncentrációjú élesztőkivonat hozzáadásával készítjük el a meghatározás céljaira szolgáló ágárlemezeket és 9 mm átmérőjű szűrőpapír-korongokat alkalmazunk. A kísérleti mikroorganizmust, a Vibrio percolans ATCC 8461 törzset 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó szokásos tápközegben (amelyet steril nátriumklorid-oldattal oly 5 mértékben hígítottunk, hogy az 660 millimikron hullámhosszon 40%-os áteresztési mutasson) éjjelen át tenyésztettük. A kapott mikroorganizmus-szuszpenziót azután 20 ml/liter arányban hígítottuk a tápközeggel és ebben az állapotban öntöttük ki a 10 lemezeket. Az így elkészített kísérleti lemezeket felhasználásig (legfeljebb 5 napig) 4 C° hőmérsékleten tároltuk. Ezután ráhelyeztük a lemezekre az antibiotikum oldatával telített szűrőpapír-korongokat és 15 az így felszerelt lemezeket 28 C° hőmérsékleten 16-24 óra hosszat inkubáltattuk. Ezután megmértük a gátlási zóna átmérőjét mm-ben. Ennek alapján számítottuk ki az antibiotikum viszonylagos hatékonyságát, illetőleg -tisztított standard-min-20 tára vonatkoztatva- az abszolút hatékonyságot jug/ml-ben. " Ilyen meghatározásokat a fermentlével, a fermentléből elkülönített micéliummal és szuszpendált tápanyaggal, valamint a szilárd anyagtól mentes 25 fermentlével végeztünk, az FR-02A antibiotikumnak valamely alkalmas oldószerbe történő extrahálása után. A 200 Mg/ml FR-02A antibiotikumot tartalmazó oldatok, 9 mm átmérőjű szűrőpapír-. -korongok alkalmazásával 16 mm gátlási zónát mu-30 tattak. Az így lefolytatott kísérlet mennyiségi meghatározásra is alkalmas, az 50-100 Mg/ml antibiotikum-koncentráció-tartományban. Az FR—02A antibiotikum Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok, továbbá Coccidium-félék 35 és Mycoplasma-félék ellen hatásos. In vitro kísérletben az FR-02A antibiotikum jó hatást mutatott az E. acervulina, Bordetella, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecum, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Proteus vulgaris, M. 40 hyorhinis, M. synoviae, M. arthritidis, M. gallisepticum és Pasteurella mikroorganizmusok ellen. Hatásosnak mutatkozott továbbá a Vibrio percolans (ATCC 8461), Salmonella gallinarum (MB 1287), E. coli (MB 1418), Klebsiella pneu-45 moniae (MB 1264), Pseudomonas stutzeri (MB 1231) és (MB 2765) Bacillus subtilis (MB 964) és (MB 797), valamint a Pseudomonas aeruginosa (MB 3210) mikroorganizmusok ellen is. Az FR-02A antibiotikum e tulajdonságai mel-50 lett jó hatással alkalmazható állatok növekedését elősegítő szerként is. Ha az FR-02A antibiotikumot gyógyászati célra, tehát antibiotikumként alkalmazzuk, akkor tetszőleges módon adhatjuk azt be orális úton az 55 állatoknak, jó eredményt érünk el bármely jelenleg szokásos kezelési mód alkalmazásával, akár 'fertőzött állatok gyógykezelése esetén, akár a fertőzésnek kitett állatok profilaktikus kezelésével. Antibiotikumként az FR-02A hatóanyagot pél-60 dául olyan gyógyszerkészítmények alakjában is alkalmazhatjuk, amelyek ezt a hatóanyagot valamely szerves vagy szervetlen, szilárd vagy folyékony, enterális, parenterális vagy helyi alkalmazásra felhasználható gyógyszerészeti vivőanyaggal összeke-65 verve tartalmazzák. Ilyen vivőanyagként olyan 4