169161. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükozidhidroláz inhibitorok előállítására az Actinomycetales rendbe tartozó törzsekkel
55 169161 56 19. példa 2% keményítőt, 1% glükózt, 0,3% glikokollt, 0,25% kukoricalekvárt, 0,4% szójalisztet, 0,1% NaCl-t, 0,1% K2 HP0 4 -et, 0,01% FeS0 4 -et és 5 0,01% CaC03 -at tartalmazó táptalajt a 12. példa szerinti módon beoltunk és inkubálunk. így 3 napos inkubálás után 2 900 AIE/ml koncentrációjú fermentlévet kapunk. 20. példa 2 darab, 1. példa szerinti táptalajt tartalmazó lombikot beoltunk a CBS 959 70 szám alatt 15 deponált Actinoplanes spec, törzs előkultúrájának 1 ml-ével és 4 napon keresztül 28 Cc-on rázógépen inkubáljuk. így centrifugálás után 250 ml térfogatú, 250 AIE/ml koncentrációjú felső réteget kapunk. 20 Ezt a 250 ml térfogatú felső réteget részletekben összekeverjük 150g ammóniumszulfáttal, majd 15 percen keresztül 10 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A maradékot feloldjuk 12 ml vízben és 3 órán keresztül desztillált vízzel szemben 25 dializáljuk. A 20 ml térfogatú dializátumot jeges fürdőben hatszoros térfogatmennyiségű (120 ml) acetonnal kicsapjuk, a csapadékot leszűrjük és acetonnal és éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk. Kitermelés 0,28 g, 220 x 103 AIE/g. 30 21. példa 120 ml, 1. példa szerinti táptalajt tartalmazó 35 1 literes Erlenmeyer-lombikot beoltunk a CBS 960 70 szám alatt deponált Actinoplanes spec, törzs előkultúrájának 2 ml-ével (amelyet a 4. példa szerinti módon állítottunk elő) és 7 napon keresztül rázógépen 28 C°-on inkubáljuk. így 40 0,09 MIE/ml koncentrációjú fermentlévet kapunk. A micéliumot 50 ml acetonnal összekeverjük, 1 percen keresztül homogenizáljuk Ultraturrax-homogenizátoron (Fa. Janke u. Kunkel, Stauffen, 45 Breisgau) és ezt követően 10 percen keresztül 3 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A maradékot ugyanolyan módon kétszer 50 ml acetonnal, majd 50 ml éterrel extraháljuk, a három extraktumot egyesítjük és rotációs bepárlóban 50 körülbelül 10-20 Hgmm nyomáson és 37 C° vízfürdő hőmérsékleten csaknem szárazra bepároljuk. A micéhummaradékot vákuumban szárítjuk, majd összekeverjük 15 ml dimetilszulfoxiddal, 2 percen keresztül Ultraturrax-homogenizátoron ho- 55 mogenizáljuk és 2 órán keresztül keverés közben extraháljuk. Ezután 30 percen át centrifugáljuk 20 000 fordulat/perc sebességgel. Ezután a dimetilszulfoxidos extraktumot leöntjük az extrahált micéliumról, az aceton/éter extrahálás maradékához 60 adjuk és körülbelül 30 percen keresztül keverjük (mágneses keverővel). Ezután újra centrifugáljuk 10 percen keresztül 20 000 fordulat/perc sebességgel és a tiszta felső réteget micéliumextraktumként vizsgáljuk, koncentrációja 0,14 MIE/ml. 65 22. példa Az 1. példa szerinti módon beoltunk 160 ml táptalajt a CBS 953 70 szám alatt deponált Ampullariella reguláris törzs előkultúrájának 1 ml-ével (amelyet az 1. példa szerinti módon állítottunk elő) és inkubáljuk. így centrifugálás után 200 ml térfogatú felső réteget kapunk, amelynek koncentrációja 360 AIE/ml. A centrifugált felső réteget részletekben összekeverjük 100 g ammóniumszulfáttal, centrifugáljuk, a csapadékot 20 ml vízben oldjuk és kétszeres térfogatmennyiségű (körülbelül 40 ml) acetonnal kicsapjuk. A csapadékot acetonnal és éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. Kitermelés: 2g, 25 x 103 AIE/g. 23. példa A 14. példa szerinti táptalajt beoltjuk a CBS 953 70 szám alatt deponált Ampullariella reguláris törzs előkultúrájával és inkubáljuk. 65 órás fermentáció után 140 AIE/ml aktivitású fermentlévet kapunk. 24. példa 120 ml 4. példa szerinti összetételű táptalajt tartalmazó 1 literes Erlenmeyer-lombikot beoltunk a CBS 954 70 szám alatt deponált Ampullariella reguláris törzs 1. példa szerinti előkultúrájának 1 ml-ével, és az 1. példa szerinti módon inkubáljuk. így 3 napos fermentáció után 50 AIE/ml aktivitású fermentlévet kapunk. 25. példa Ha a 24. példa szerinti táptalajban a glicerint glükózzal helyettesítjük, 3 napos fermentáció után 60 AIE/ml aktivitású fermentlévet kapunk. 26. példa Ha a 24. példa szerinti táptalajt az 1. példa szerinti táptalajjal helyettesítjük és a keményítő helyett glükózt használunk, 3 napos tenyésztés után 140 AIE/ml aktivitású fermentleveket kapunk. 27. példa A CBS 954 70 szám alatt deponált Ampullariella reguláris törzs előkultúrájának (amelyet a 4. példa szerinti módon állítottunk elő) l-l ml-ével beoltunk 5 db 1 literes Erlenmeyer-lombikban levő 120—120 ml táptalajt, amelynek összetétele: 3% glükóz, 0,5% NZ-amin, 1,0% élesztőextraktum, 0,4% CaC03 (sterilizálás: 30 perc 121 C°on, pH-érték sterilizálás előtt 7,2) és 3 napon keresztül rázógépen 28 C°-on inkubáljuk. így centrifugálás 28
