169161. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükozidhidroláz inhibitorok előállítására az Actinomycetales rendbe tartozó törzsekkel
53 169161 54 11. példa A 9. példa szerinti módon beoltjuk egy 120 ml, 1. példa szerinti táptalajt tartalmazó 1 literes Erlenmeyer-lombik tartalmát és 6 napon keresztül rázógépen 28 C°-on inkubáljuk, így 0,9MIE/ml koncentrációjú szűrletet kapunk. 12. példa A CBS 958 70 szám alatt deponált Actinoplanes spec, törzs előkultúrájának két-két ml-ével (amelyet az 1. példa szerinti módon nyertünk ki) beoltunk 5 darab 1 literes Erlenmeyer-lombikban levő 120—120 ml térfogatú táptalajt, amelynek az összetétele: 2,5% keményítő, 0,5% glükóz, 0,5% NZ-amin, 1,0% élesztő extraktum, 0,4% CaC03 (sterilizálás: 30 perc 121 C°-on, a pH-t a sterilizálás előtt 7,2 értékre állítottuk be) és 4 napon keresztül rázógépen 28 C°-on inkubáljuk. így a lombikok tartalmának egyesítése és a micélium centrifugálása után 500 ml, 70 AIE/ml koncentrációjú felső réteget kapunk. A centrifugált felső réteget befagyasztjuk és liofilizáljuk. Kitermelés: 7,7 g, 3,5 xlO3 AIE/g. 13. példa Az 1. példa szerinti táptalajt beoltjuk a CBS 957 70 szám alatt deponált Actinoplanes spec, törzs előkultúrájának 2 ml-ével (amelyet az 1. példa szerinti módon állítottunk elő) és 3 napon keresztül 28 C°-on inkubáljuk. így olyan tenyészlevet kapunk, amely 1100 AIE/ml, 0,17MIE/ml és 1,0 SIE/ml koncentrációjú. 14. példa 5 darab, 8-8 liter 1. példa szerinti táptalajt tartalmazó kísérleti fermentort beoltunk 120-120 ml 1. példa szerint készített előkultúrával és keverés és levegőztetés közben 65 órán keresztül 28 C°-on inkubáljuk. így a fer mentievek egyesítése és a micélium elválasztása után 30 liter tenyészszűrletet kapunk. Ezt a 30 liter centrifugált tenyészlevet (0,57 MIE/ml, 6,2 SIE/ml, 8000 AIE/ml) vákuumban 20 torr nyomáson és 100 C° fürdőhőmérsékleten 5 liter térfogatra bepároljuk, a koncentrátumot négyszeres térfogatmennyiségű (20 liter) acetonnal keverés közben összekeverjük és a kiváló fekete, kenőcsszerű csapadékot 30 percen át centrifugáljuk 6000 fordulat/perc sebességgel. Az így összegyűjtött csapadékot 2,5 liter vízben feloldjuk és a feketére színeződött oldatot 60 percen keresztül keverjük 500 g nedves Amberlite IRA 410 (acetát alak, ph: 7) ioncserélővel. Ezután 10 percen keresztül centrifugáljuk 6000 fordulat/perc sebesseggel, így egy felső rétegre és Amberlite-üledékre választjuk szét. A felső réteget ugyanolyan módon még háromszor 60 percen keresztül keverjük 500—500 g Amberlite ioncserélővel, majd ezt követően éjszakán át (körülbelül 15 óra) újabb 500 g Amberlite ioncserélővel. Ilyen kezelés után a felső réteg halvány sárga színű, a fekete színű kísérőanyagokat az ioncserélő megkötötte. Az összegyűjtött Amber-5 lite-maradékokat kétszer 1,5 liter vízzel moss\ik és ezeket a mosóvizeket egyesítjük az inhibitort tartalmazó felső réteggel. A mosóvizekkel egyesített felső réteget rotációs bepárlóban 15 torr nyomáson és 80 C° fürdőhőmérsékleten 1 liter térfogatra 10 bepároljuk és ezt követően erős keverés közben 10 liter acetonba csepegtetjük. Ekkor fehér csapadék keletkezik, ezt leszűrjük, acetonnal és éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. Kitermelés: 150g fehér por, 1 x 106 AIE/g és 450 SIE/g. 15. példa Az 1. példa szerinti táptalajban a glükózt egyéb 20 cukorral vagy cukoralkohollal helyettesítjük és a rázott 120-120 ml táptalajt beoltjuk a CBS 957 70 szám alatt deponált Actinoplanes spec, törzs előkultúrájának egy-egy ml-ével (amelyet az 1. példa szerinti módon állítottunk' elő). Ezután 3, 25 ül. 4 napon keresztül rázógépen 28 C°-on inkubáljuk, így az alábbi amiláz-inhibitor-koncentrációjú tenyészoldatokat kapjuk: 1-1% AIE/ml AIE/ml 30 adalék 3 nap múlva 4 nap múlva nyerscukor 5 400 10 500 laktóz 9 100 4 600 maltóz 7 500 13 600 35 galaktóz 9 100 10 200 glükóz 7 000 9 700 szorbit 2 600 10 200 mannit 8 500 8 700 inozit 4 800 5 600 keményítő 6 400 10 200 16. példa 3% szójalisztet, 2% keményítőt, 1% glükózt és 45 0,2% kalciumkarbonátot tartalmazó táptalajt a 15. példa szerinti módon beoltunk és inkubálunk. így 4 napos fermentáció után 5 600 AIE/ml koncentrációjú fermentlevet kapunk. 17. példa A 13. példa szerinti táptalajt beoltjuk a CBS 613 71 szám alatt deponált Actinoplanes spec. 55 törzzsel és inkubáljuk. 4 napos fermentáció után 27 400 AIE/ml koncentrációjú fermentlevet kapunk. 18. példa 60 A 13. példa szerinti táptalajt beoltjuk a CBS 612 71 szám alatt deponált Actinoplanes spec. törzzsel, majd inkubáljuk. 4 napos fermentáció után 13 900 AIE/ml koncentrációjú fermentlevet 65 kapunk. 27
