169161. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükozidhidroláz inhibitorok előállítására az Actinomycetales rendbe tartozó törzsekkel
51 169161 52 fugálással összegyűjtjük, acetonnal kétszer és éterrel egyszer mossuk, majd vákuumban szobahőmérsékleten megszárítjuk. Kitermelés: 2,2 g 15 x 103 AIE/g. 3. példa 5 Az 1. példa szerinti módon eljárva 5 napos tenyésztés után 500 ml, 120 AIE/ml koncentrációjú centrifugált felső réteget kapunk. Ezt az 500 ml mennyiséget közvetlenül liofilizáljuk. Kitermelés: 7,1 g 8,3 xlO3 AIE/g. 4. példa 15 A CBS 956.70 szám alatt deponált Actinoplanes spec, törzs előkultúrájának l-l ml-ével (amelyet ugyanabban a táptalajban állítottunk elő, Czapek-pepton-kazein-agar ferde kémcsős kultúrából beoltva) beoltunk 3 darab 1 literes Erlenmeyer-lom- 20 bikban levő 200 ml térfogatú táptalajt, amely az alábbi összetételű: 3% glicerin, 3% szójaliszt, 0,2% CaC03 (sterilizálás: 30 perc 121 C°-on, pH sterilizálás után 7,2) és 3 napon keresztül 28 C°-on rázógépen inkubáljuk. Ezután a lombikok tartalmát 25 egyesítjük és a micéliumot centrifugálással elválasztjuk. 500 ml, 450 AIE/ml koncentrációjú felső réteget kapunk. A felső réteget keverés közben összekeverjük 250 g ammóniumszulfáttal, amelyet részletekben 30 adagolunk, majd 10 percen át 12 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A csapadékot feloldjuk 100 ml desztillált vízben, majd összekeverjük négyszeres térfogatmennyiségű (400 ml), acetonnal. Jól ülepedő csapadék képződik. A csapadékot 35 dekantálással elválasztjuk és acetonnal kétszer, majd éterrel egyszer mossuk és vákuumban szárítjuk. Kitermelés: 13,4g 10 x 103 AIE/g. 40 5. példa A 4. példa szerinti módon járunk el, majd az ammóniumszulfátos lecsapás után kapott csapadékot 100 ml vízben feloldjuk és 6 órán át dializáljuk 45 desztillált vízzel szemben. A dializátumot befagyasztjuk és liofilizáljuk. Kitermelés: 1,5 g 80 AIE/mg. 6. példa 50 Az ATCC 3319 szám alatt deponált Streptomyces flaveolus törzs ferde kultúrájával beoltjuk az 1. példa szerinti táptalaj 120ml-ét 1 literes Erlenmeyer-lombikban. így 3 napos 28C°-on végzett 55 (rázógépen) tenyésztés után olyan tápoldatot kapunk, amely 25 AIE/ml koncentrációjú. 7. példa 60 A 4. példa szerinti módon járunk el, a tenyésztést 3 napon keresztül végezzük 32 C°-on. így a micélium leszűrése után olyan szűrletet kapunk, amely 350 AIE/ml koncentrációjú. 65 8. példa Az 1. példa szerinti táptalajt a 4. példa szerinti módon oltjuk be. így 3 napos, 28 C°-on végzett tenyésztés után olyan szűrletet kapunk, amely 270 AIE/ml koncentrációjú. 9. példa A CBS 952 70 szám alatt deponált Ampullariella reguláris törzs előkultúrájának 1—1 ml-ével (amelyet ugyanabban a táptalajban állítottunk elő, amit az 1. példában ismertettünk) beoltunk 6 darab 1 literes Erlenmeyer-lombikban levő 100 ml térfogatú táptalajt, amelynek összetétele: 3% glükóz, 3% szójaliszt, 0,2% CaC03 (sterilizálás: 30 perc 121 C°-on, pH sterilizálás után 7,2) és 4 napon keresztül 28 C°-on inkubáljuk rázógépen. Ezután a lombikok tartalmát egyesítjük és a micéliumot centrifugálással elválasztjuk. A kapott 500 ml térfogatú, 150 AIE/ml koncentrációjú felső réteget befagyasztjuk és liofilizáljuk. Kitermelés: 6,9 g llxlO3 AIE/g. 10. példa 24 darab Erlenmeyer-lombikban levő, a 4. példa szerinti módon készített táptalajt, amelynek térfogata 120 ml, beoltunk a CBS 955 70 szám alatt deponált Actinoplanes spec, törzs (a 4. példa szerinti módon nyert) előkultúrájával és 5 napon keresztül 28 C°-on inkubáljuk. így centrifugálás után 2,0 liter, 1,1 MIE/ml koncentrációjú felső réteget kapunk. Ezt rotációs bepárlóban 200 ml térfogatra bepároljuk. Ezt a 200 ml térfogatú koncentrátumot 24 órán át Visking-féle dializáló csőben (Typ 27/100 FT, Union Carbide Corporation) dializáljuk 2 liter desztillált vízzel szemben, szobahőmérsékleten. Az inhibitort tartalmazó külső közeget 100 ml térfogatra bepároljuk és keverés közben becsepegtetjük 900 ml abszolút etanolba. A leváló, csaknem inaktív csapadékot centrifugáljuk és eldobjuk, az alkoholos felső réteget 30 ml térfogatra bepároljuk. Ennek a koncentrátumnak 1 ml-e 70 MIE/ml koncentrációjú. Ezt az oldatot további tisztítás céljából anioncserélő oszlopra visszük (Amberlite IRA 410, acetát forma 0,05 m ammóniumacetát, pH: 7, 2,5 x 20 cm méretű oszlop), az aktív frakciókat egyesítjük és Sephadex G 75-n vízben gélszűrjük. A gélszűrés aktív frakcióit 12 ml térfogatra bepároljuk. Ez az oldat 150 MIE/ml koncentrációjú. A micéliumot (kb. 500 ml) 2 x 1 liter acetonnal és 1 x 1 liter éterrel extraháljuk, az extraktumokat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. A micélium maradékot vákuumban 20 C°-on szárítjuk és a kapott száraz micéliumport (kb. 51 g) ezt követően két órán keresztül szobahőmérsékleten extraháljuk 150 ml dimetilszulfoxiddal. Centrifugálás után (30 perc, 15 000 fordulat/perc) a szárazra párolt aceton/éter extraktumot felvesszük a száraz micéliumpor dimetilszulfoxidos felső rétegével. Kitermelés: 120 ml, 3 MIE/ml. 26
