169120. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil víruskészítmények előállítására
5 169120 6 38,5 C°-on adszorbeáltatjuk. Ezután a tenyészeteket 38,5C°-on inkubáljuk, és 4-5 napos inkubációs idő elteltével megszámláljuk a.sérült centrumokat. Az 1. táblázatban megadott számadatok két titrálás eredményei, a foltképző egység (FKE)/ml értékeket a két párhuzamos tenyészetben meghatározott átlagos centrumszámból és a hígítási faktorból számítottuk ki. -1. táblázat £3* Iá* 'SS' fss l'ss a-s Stabüizálószer «"^ '£?£< 3"3ÍR SPGE + 1% A 49 22 45 SPGE + 1% K15 65 24 37 SPGE + 1% K30 64 12 18,5 SPGE + 1% K90 44 6 1,4 A táblázat jelölései: SPGE = 0,218 mól szacharózt, 0,0038 mól kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,0072 mól dinátrium-hidrogénfoszfátot, 0,0049 mól monokálium-glutamátot és 0,2% nátrium-etiléndiamintetraacetátot tartalmazó, 7,2 pH- értékű vizes oldat A = bovin albumin-por KI 5 = 10 000 átlagmolekulasúlyú polivinil-pirrolidon K30 = 40 000 átlagmolekulasúlyú polivinil-pirrolidon K90 = 360 000 átlagmolekulasúlyú polivinil-pirrolidon. Az 1. táblázatban közölt számadatok a polivinil-pirrolidon molekulasúlya és stabilizáló hatása közötti összefüggést mutatják be. A molekulasúly nem befolyásolja lényegesen a besugárzás során kifejtett stabilizáló hatást, azonban a liofílizálási 50 lépésben döntő szerephez jut. A polivinil-pirrolidon a vírust mind a besugárzási, mind a liofílizálási lépés alatt stabilizálja, feltéve, hogy elég kis molekulasúllyal rendelkezik. A KI 5 jelű polivinil-pirrolidon és a bovin albumin stabilizáló hatása között 55 nincs jelentős különbség. 2. példa Az 1. példában leírt módon nagy vírus-faktorú 60 csirke-embrió kötőszövet-tenyészetet készítünk, majd a tenyészetet az 1. példában leírtak szerint kezeljük. Az eredményeket a 2. táblázatban közöljük, az adatokat az 1. táblázattal kapcsolatban ismertetett módon mértük, illetve számítottuk. 65 2. táblázat 3 1 .52 -& & Si Stabüizálószer Liofílizálás utáni faktor (xl03 )FKE 0*$$ °-aí£ <n 3© O <2 "" a t: a t-3 2 Maradék aktivitás a tárolás után,% 392 SPGE + A 117 59 50 SPGE • K30 57 29 50 393 SPGE + A 132 60 45,5 SPGE + KI 5 122 59 48 394 SPGE + A 199 88 44 SPGE • KI5 218 93 43 A 2. táblázat adataiból látható, hogy a KI 5 jelű polivinil-pirrolidon az 1. példában felhasználtnál 10-20-szor nagyobb faktorú víruskészítményeket is 25 kitűnően stabilizálja. A bovin albumin és a KIS'jelű polivinil-pirrolidon stabilizáló hatása között ebben az esetben sem észleltünk jelentős különbséget, a K30 jelű pohvinil-pirrolidon a liofílizálási lépésben azonban 30 ebben az esetben is kevésbé hatásos a bovin albuminnál, illetve a KI 5 jelű poíivinil-pirrolidonnaL A 2. táblázat adataiból megállapítható, hogy a liofilizált anyagok - a felhasznált stabilizálószertől függetlenül - erélyes körülmények közötti (7 nap, 35 37 C°) tárolás során egyaránt stabilok maradtak. 3. példa , 40 30 lépéses sorozattenyésztésnek alávetett humán embrionális tüdő-kötőszövet-tenyészetet (WI-38) 1 literes lombikban egy WI-38 szövettenyészeten 43 lépéses sorozattenyésztésnek alávetett varicella zoster vírus Temple törzsével (The Wistar Institute) 45 megfertőzött, teljes embrionális tüdő-kötőszövet sejtjeivel oltunk be. Növesztő táptalajként az 1. példában ismertetett közeget használjuk. Az inokulumot olyan mennyiségben adagoljuk, hogy 3 napos 35 C°-os inkubálás után csaknem teljes mértékű citopatogén hatást érjünk el. Ekkor az egyrétegeket nátrium-etiléndiamin-tetraacetát oldattal elkülönítjük. A megfertőzött sejteket összegyűjtjük, centrifugáljuk, majd a sejttömeget 3 egyenlő részletre osztjuk. Az így kapott sejttömeg-részleteket - amelyek 3 tenyésztési lombikból származó anyagmennyiségnek felelnek meg - 30-30 ml, a 3. táblázatban felsorolt stabilizátor-kompozícióval elegyítjük, és a kapott sejtszuszpenziókat az 1. példában ismertetettel azonos, maximális energiára beállított készülékkel 2 percig besugározzuk. A besugárzás után a szuszpenziót 3/K-os membránon szűrjük. Minden szuszpenzióból besugárzás előtt, besugárzás után és szűrés után mintát veszünk. A vírus-titrálás céljaira az 3
