169116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén, haptén vagy antitest kimutatására és meghatározására

13 169116 14 léten forgókeverőben tartjuk. Ezután a folyékony és a szilárd fázist centrifugálással elválasztjuk egymástól. A felső fázis enzimaktivitását az 1. példa szerinti módon mérjük. A birka-anti-ösztradiol szérumot a felhasznált ösztradiol-17-szukcinil-HRP minőségétől függően 1 :600 - 1 :12 800 hígításban használjuk. 1:12 800 hígítás mellett az antiszérum ösztradiol koncentrációja, amely 10 ng/ml, még meghatározható a mintában, ösztradiol és ösztron keresztreakciót mutat ebben a rendszerben. 4. példa Kortizol és kortikoid-kötő globulin meghatározása a) Kortizol-21-(galaktóz-oxidáz) készítése (haptén-enzimkomplex) 50 mg Kortizol-21-hemiszukcinátot és 100 mg galaktóz-oxidázt a 3 a) példa szerinti kevert anhidrides módszerrel kapcsolunk. b) Kortikoid-kötő globulint (CBG) izolálunk emberi vérszérumból kromatográfiás úton DEAE cellulóz és hidroxiapatit segítségével (Organon-készítmény) (haptén-antitest). A globulin elleni antitesteket úgy készítjük, hogy nyulaknak 14 napos időközökben injekció útján 500 mikrogramm CBG-t adunk Freund-féle teljes adjuvánsban. 3 hónap eltelte után a kísérleti állatokba 1 mg CBG-t injekció útján beviszünk, majd 2 héttel később az állatok vérét lecsapoljuk. c) Az anti- CBG szérum gamma-globulin frakcióját a 3. példa szerinti eljárással m-amino-benziloximetilcellulózhoz kapcsoljuk (haptén-anti-antitest). d) Kortizol meghatározása 0,5 ml kortizol-tartalmú mintát (standard oldat) (Organon-készítmény) 2 x 3 ml metilénkloriddal extrahálunk. Az egyesített kivonatokat szárazra pároljuk. A maradékot 0,5 ml 6,2 pH-értékű 0,05 mólos foszfát-pufferben felvesszük, majd megfelelő koncentrációban 0,1 ml CBG-t adunk hozzá ugyanabban a pufferoldatban. A kapott keveréket 30 percig 4 C°-on inkubáljuk. Ezután 0,1 ml kortizol-21-(galaktóz-oxidáz)-t adunk hozzá szintén megfelelő hígításban, végül 0,3 ml c) példa szerinti eljárással készített immunoadszorbenst 5 mg/ml koncentrációértéken. A keveréket 2 óra hosszat 4C°-on forgókeverőben tartjuk, majd centrifugáljuk, ezután a felső fázisban az enzimaktivitást mérjük. Ebből a célból a fenti anyagból 0,5 ml-t adunk 100 mg D-galaktózt, (Merck-készítmény) 20 mg 5-aminosavat és 10 mikrogramm peroxidázt tartalmazó 1,5 ml szubsztrátumhoz, amelyet 150 ml 6,0 pH-értékű 0,02 mólos foszfát-pufferben veszünk fel. 30 perc eltelte után az extinkciós értéket 460 nm hullámhosszon mérjük. Ha a CBG koncentrációt 0,4 mikrogramm/ml értékre állítjuk be és annyi kortizol-21-m(galaktóz-oxidázt) (Boehringer-készítmény) adagolunk hogy szteroidok hozzáadása nélkül az enzimkomplex 5 80%-a az immunoadszorbensen megkötődik, akkor lehetővé válik 3-30 ng kortizol mennyiségek meghatározása. d) Az előbbi reagenssel lehetővé válik a CBG 10 meghatározása is. 0-1280 ng/ml hígítási határok között levő transzkortin (kortizol antitest) sorozathígításból 0,5 ml-t 15 percig 0,2 ml kortizol-21-galaktóz-oxidázzal inkubálunk megfelelő hígításban. Ezután 0,3 ml immunoadszorbens szuszpenziót 15 (5 mg/ml) adunk hozzá és a keveréket 15 percig forgókeverőben tartjuk. A két inkubálást 4 C°-on végezzük. Ezután a felső fázis enzimaktivitását a d) szerinti módszerrel mérjük. A kísérleti rendszer érzékenysége 50 ng/ml. 5. példa Egy palackban a következő reagenseket külön-25 álló rétegek alakjában liofilizáljuk: 1. la) példa szerinti 0,3 ml immunoadszorbens szuszpenzió (10 mg/ml), 2. 0,1 ml 1%-os mannit-oldat, 30 3. 0,1 ml 1 a) példa szerinti HCG-HRP, 4. 0,1 ml 1%-os mannit-oldat második réteg, 5. 0,1 ml 1 b) példa szerinti nyúlszérum (anti-HCG). 35 Ehhez a liofilizált keverékhez 0,5 ml vizelet mintát, majd 0,5 ml desztillált vizet adunk. 10 perc eltelte után a felső fázis enzimaktivitását olyan papírcsíkkal mérjük, amelyet karbamiddal, hidrogénperoxiddal és o-tolidinnal impregnáltunk. 40 Ha a vizelet-minta terhes nőtől ered (2 nemzetközi egység HCG/ml), 5 percen belül kék szín jelenik meg, míg ugyan ezen időszakon belül nem terhes asszonytól származó vizelet-minta esetén elszíneződés nem lép fel. 6. példa a) Immunoglobulin G-alkáli-foszfatáz 50 konjugátum előállítása (antigén-enzimkomplex) 5 mg humán immunoglobulin G-t (Organon-készítmény) és 15 mg alkáli foszfatázt (Boehringer-55 -készítmény) 1 ml 0,1 mólos nátriumfoszfát puffer-oldatban (pH : 6,8) 2 óra hosszat szobahőmérsékleten 0,2% glutáraldehiddel reagáltatunk Az elegyet dializáljuk, majd Sephadex G—200 oszlopon frakcionáljuk. 60 b) Humán immunoglobulin G antitest előállítása Az előállítást nyúlban végezzük ez előző példák-65 ban leírtak szerint. 7