169116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén, haptén vagy antitest kimutatására és meghatározására

11 169116 12 e) Az inzulinnal szembeni antitestek meghatározása 0,1 ml inzulin-(glukóz-oxidázt) megfelelő hígításban 0,4 ml tengerimalac anti-inzulin szérum sorozathígítású mintáival inkubálunk 4 óra hosszat. A sorozathígítást 6,0 pH-értékű 0,05 mólos foszfátpufferrel végezzük. Ezután 0,3 ml (15 mg/ml) immuno-adszorbenst és 0,2 ínl puffer-oldatot adunk hozzá, a keveréket éjjelen keresztül 4 C°-on forgó-keverőgépben rázogatjuk. Centrifugálás után a felső fázis enzimaktivitását úgy határozzuk meg, hogy 0,5 ml alikvot részt 2,5 ml szubsztrátummal 30 percig inkubálunk, majd 460 nm hullámhosszon az extinkciós értékét mérjük. A szubsztratum 50 mg glukózt, lOmikrogramm peroxidázt és í mg 5-aminoszalicilsavat tartalmaz 2,5 ml 6,0 pH-értékű 0,05 mólos foszfátpufferre számítva. A fenti meghatározási rendszer segítségével különböző szérumok antitest-tartalma egymás között összehasonlítható. Hivatkozási pontként azt a szérumhígítási értéket választjuk, ahol a teljes kapcsolható enzimaktivitás 50%-ára csökken. f) Az inzulin meghatározása 0,2 ml sorozathígítású inzulint 2 óra hosszat 0,4 ml anti-inzulin szérummal inkubálunk olyan hígításban, hogy az az enzim-konjugátum 60%-ának megkötésére képes. Ezután 0,1 ml inzulin (glukóz-oxidázt) adunk hozzá a megfelelő hígításban és ezzel 4 óra hosszat inkubáljuk. Végül 0,3 ml (15 mg/ml) immunoadszorbenst adunk hozzá. A keveréket forgókeverőgépben tartjuk éjjelen át 4C°-on, centrifugálás után meghatározzuk a felső fázis enzimaktivitását. A meghatározás érzékenysége, amely a használt, antiszérumtól függ, a 20-100 nm/ml nanogramm tartományba esik, vagyis 0,5 — 2,5 nemzetközi egység/ml. 3. példa Ösztradiol meghatározása a) Ösztradiol-17-szukcinil-HRP készítése (haptén-enzim-komplex) 50 mg ösztradiol-17-hemiszukcinátot (Organon készítmény) és 0,08 ml tri-n-butilamint 2,5 ml dioxánban feloldunk. A hideg (2 C°) oldathoz 15mikroliter klórhangyasav-izobutilésztert adunk. 30 perc eltelte után ehhez az oldathoz 100 mg torma (horse radish) peroxidázt (HRP) (Merck készítmény) adunk 2 :3 arányú dioxán-víz elegyben (7,5 ml), amelyet nátriumhidroxiddal 9,5 pH-értékre állítottunk be. Az oldatot 4 óra hosszat 2C°-on keverjük, majd 18 óra hosszat dializáljuk. A dializátum pH-értékének, 4,6-re való beállítása után képződött csapadékot centrifugáljuk, mossuk és 5 ml 8pH-értékre beállított desztillált vízben felvesszük. Az anyagot tovább tisztítjuk azáltal, hogy kétszer 10-10 ml acetonnal kicsapjuk. A készterméket 10 ml 0,05 mólos 7,8 pH-értékű foszfátpufferben felvesszük. b) ösztradiol-17-szukcinil-BSA készítése A készítményt a 3 a) példa szerinti módon kevert anhidrides módszerrel készítjük. Ennél a 5 készítménynél 100 mg ösztradiol-17-hemiszukcinátból és 150 mg marhaszérum-albuminból (BSA) (Armour készítmény) indulunk ki. c) ösztradiollal szembeni antitestek 10 készítése (antitest) Birkát négy hetenként egyszer 4 mg Freund-féle teljes adjuvánsban felvett ösztradiol- 17-szukcinil-BSA-val kezelünk injekció alakjában. Szabályos 15 időközökben a birkáktól vért veszünk. A kapott vérszérumot BSA-n adszorbeáljuk, amelyet oldhatatlanná alakítunk át. d) Birka-gamma-globulinnal szembeni 20 antitestek készítése (haptén-antitest) Az 1. példa szerint birka-gamma-globulint készítünk, azonban ehhez 16 súly% nátriumszulfát oldatot alkalmazunk. 25 Nyulakat az előbbi birka-gamma-globulinnal immunizálunk a következő előírás szerint: Freund-féle Nap Mennyiség adjuváns Injekciós mód 0 200 mikrogramm + intramuszkuláris 14 400 mikrogramm + intramuszkuláris 35 28 800 mikrogramm + intramuszkuláris 42 800 mikrogramm — intravénás 40 Az utolsó injekció után 2 héttel az állatok vérét lecsapoljuk. e) Az immunoadszorbens (nyúl-anti/-birka-gamma-globulin/-cellulóz készítése 45 (haptén-anti-antitest) A d) alatti módszerrel készített antiszérum gamma-globulin frakcióját állítjuk elő 18 sűly%-os nátriumszulfát-oldattal való kicsapással. Az így kapott 50 terméket a Gurvich-módszer szerint cellulózzal kapcsoljuk az 1. példában leírt eljárással. f) Az ösztradiol meghatározása 55 Az immunreakciót 6,0 pH-értékű 0,02 mólos foszfátpufferben végezzük, amely 2% BSA-í tartalmaz. 0,5 ml mintát 0,1 ml birka-anti-ösztradiol szérummal keverünk el a kívánt hígításban. 30 perc 60 inkubálási idő után szobahőmérsékleten 0,1 ml ösztradiol-17-szukcinil-HRP-t adunk hozzá megfelelő hígításban, majd további 30 perces inkubálási időt állítunk be szobahőmérsékleten. Ezután 0,3 ml immunoadszoibens-szuszpenziót (30 mg/ml) adunk 65 hozzá és a keveréket 2 óra hosszat szobahőmérsék-6