169022. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kopolimer hordozóra felvitt vízoldhatatlan fehérje-készítmények előállítására
9 169022 10 hatók kötött inhibitorok vagy szubsztrátanalóg vegyületek segítségével. Ismeretes .pl. a tripszin és kimotripszin kinyerése kötött növényi vagy állati eredetű inhibitorokkal. Más példák erre a peptidekhez speciálisan kötött peptidázok vagy a plazmin 5 elkülönítése hordozóhoz kötött lizinnel. Erről az alkalmazásterületről megjelent összefoglaló közlemények a következők: Feinstein, G. Naturwissenschaften 58, 389 (1971) és Fried, F. Chromatographic Reviews 14, 121 (1971). "> A 6-aminpenicillánsav (6—APS) előállítására a penicillineket acilázok segítségével mikroorganizmusokból mint pl. baktériumokból főként E. coli, Erwinia vagy Actinomycetes-ből mint Streptomyces, Micromonospora Nocardia és gombák, mint 15 Fusarium és élesztők segítségével hasítjuk. Az 1111 778 számú NSzK szabadalmi leírás 6—APS előállítására ismertetett eljárása szerint penicillin G-oldatot egy baktérium iszappal hozunk össze, amely a penicillin-aciláz enzimet (B.C. 2 ° 3.5.1.11.) tartalmazza. Az enzim behatása alatt a penicillin oldalhelyzetű karbonamid-csoportja lehasad anélkül, hogy a j3-laktámgyűrű felnyílna. A mikroorganizmus-szuszpenziók alkalmazásának a következő hátrányai vannak: 25 a) a mikroorganizmusok szuszpenziója az intracelluláris penicillin-acilázon kívül további fehérjéket és enzimeket, valamint a táptalajból és annak átalakulási termékeiből olyan komponenseket tartalmaz, 30 amelyek a fermentáció során képződtek. Ezek a szennyeződések a feldolgozásnál nem teljesen moshatók ki a kristályos 6-APS-ből. b) A mikroorganizmusok szuszpenziója gazdaságosan, célszerűen csupán egyszer használható fel. 35 c) A mikroorganizmusok szuszpenziója olyan szennyezéseket és más enzimeket tartalmaz, amelyek a penicillint és/vagy 6-APS-t a 0-laktámgyűrű felnyitása útján dezaktiválják. d) A szuszpenzió csak kisebb mennyiségben 40 tartalmaz penicillin-acilázt. Nagyobb mennyiségű enzim felhasználása pl. rövidebb reakcióidő és ezzel jobb 6-APS hozam elérése céljából gyakorlati szempontból megoldhatatlan idegen kísérő szennyezések alacsony szinten tartásával. 45 e) A 6-APS-ben kifejezett üzemi hozamok a csökkenő penicillin-aciláz képződéstől függnek a mindenkori fermentációs adagokban. f) A szuszpendált mikroorganizmusok teljes leválasztása a 6—APS-adagok feldolgozásánál pótlóla- 50 gos munkafolyamatot jelent, amely a hozam csökkenésére vezet. A fehérjeszerű szennyeződések eltávolítására - amelyek allergénreakciókat okozhatnak — további tisztítási műveletek beiktatása szükséges (vö. 1169 696, 1078 847 és 1114 311 55 számú brit szabadalmi leírások). Az összes felsorolt hátrány elkerülhető, ha a mikroorganizmusok szuszpenziója helyett olyan penicillin-acilázt alkalmazunk, amely kovalens kö- 60 téssel egy vízoldhatatlan hordozóanyaghoz van rögzítve. 6-APS előállítására irányuló kísérletek penicillinek enzimatikus hasítása útján hordozókhoz rögzített penicillin-aciláz segítségével ugyan ismére- 65 tessé váltak (vö. 1917 057 és 1907 365 számú NSzK közrebocsátási iratok), de ezeket az eljárásokat ipari méretben nem sikerült átvenni. Ennek oka egyrészt a felhasznált hordozóanyagok mechanikai tulajdonságaival függ össze, amely nem elég kopásálló, másrészt mérsékelt eljárási kihozatalok mellett csak gyenge specifikus aktivitás érhető el a hordozókhoz kapcsolt penicillin-acilázok segítségével. A 2 157 970 számú NSzK szabadalmi nyilvánosságrahozatali iratból ismert oldhatatlan enzim alkalmazása is, amely penicillin-aciláz kovalens kötéssel rögzítve egy akrilamidból N,N'-metilén-bisz-akrilamidból és maleinsavanhidridből nyert keverékpolimerhez hátrányos a penicillin ipari méretű bontásánál, mivel az oldhatatlan enzim erős mértékben duzzad és mechanikai szempontból nem ellenállóképes. Ezek a hátrányok az előállított gyanták ismételt felhasználását ipari méretben befolyásolják. Azt találtuk, hogy a felsorolt hátrányok elkerülhetők, ha a találmány szerinti vízoldhatatlan hordozóanyaghoz rögzített penicillin-acilázt alkalmaztuk a penicillinek hasítására. A penicillinek hasítása a találmány szerinti hordozóanyaghoz kötött penicillin-aciláz segítségével egyszerűen és nagyüzemi méretben is kivitelezhető. A hordozóhoz kötött oldhatatlan enzimet 75 000 - 150 000 NE/ml tartalmazó penicillint, pl. G-penicillint vagy V-penicillint tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. Az enzimatikus hasítást állandó pH-értéken 6- és 9 között előnyösen mindenkor a rögzített penicillin-aciláz pH-optimumának tartományában pl. 7,8 pH-értéken végezzük. A lehasított acilgyök pl. a fenilecetsav vagy a fenoxiecetsav semlegesítésére vizes alkáli-oldatokat, pl. káliumhidroxidot vagy nátriumhidroxidot vagy szerves aminokat, előnyösen trietilamint alkalmazunk. A lúg felhasználásából megállapítható a hasítás reakciósebessége és befejeződése. A penicillin-aciláz katalizátor hatást fejt ki mind a penicillin elbontására 6-APS-sé, mind a penicillin újbóli szintézisére a bomlástermékekből. Az egyensúly a közeg pH-értékétől függ. Alacsonyabb pH-értéken az egyensúly a kiindulási anyagként használt penicillin kiinduló anyag javára tolódik el. Ez a jelenség hasznosítható penicillinek átacilezésére más acilgyökök jelenlétében vagy penicillinek szintézisére 6—APS-ből kiindulva. Az enzimatikus hasítás reakcióhőmérséklete előnyösen 38 C°. Alacsonyabb hőmérsékleten az enzim aktivitása csökken. A hasítást pl. 25 C°-on végezve kétszerakkora mennyiségű enzimet kell alkalmazni, mint 38 C°-on, feltéve, ha azonos reakcióidő leforgása alatt kívánjuk a reakciót befejezni. A reakciósebesség az adott hőmérsékleten a hordozóhoz kötött penicillin-aciláz specifikus aktivitásától és a mennyiségtől függ. Ezenkívül a reakciósebesség függ a hordozóanyaghoz kötött penicillin-aciláz mennyiségének arányától a penicillin koncentrációjához képest. Egy hasítási reakcióelegy, amelynek koncentrációja 100 000 NE/ml (1 mg G-kálium-penicillin megfelel 1598 NE nemzetközi egységnek) 10 óra leforgása alatt 7,8 pH-értéken és 38 C°-on teljesen hidrolizálódik 6-APS-sé és fenilecetsavvá, ha egy egység penicillin-acilázra számítva :>
