169022. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kopolimer hordozóra felvitt vízoldhatatlan fehérje-készítmények előállítására
11 169022 12 3 x 10 s egység G-penicillint alkalmazunk, (1 enzimegység (E) úgy határozható meg, mint az az aktivitás, amely egy mikrómól 6-nitro-3-(fenilacetil)-aminobenzoesavat, (NIPAB) 1 perc alatt 25 C°-on hidrolizálni képes). A száraz enzimgyanta mennyi- 5 sége csupán 0,5—1% a reakciókeverékre számítva. Ha 10s NE G-penicillinre számítva 2 egység penicillin-acilázt alkalmazunk, akkor ar teljes mértékű hasítás mindössze 2 órát vesz igénybe. Ennél rövidebb reakcióidő is megvalósítható, ha még nagyobb 10 mennyiségű penicillin-acilázt alkalmazunk, továbbá, ha kristályos enzimből készült hordozóhoz rögzített penicillin-acilázt alkalmazunk. A találmány szerinti hordozóhoz rögzített peni- 15 cillin-aciláz gyöngyformában állítható elő, és nagy mechanikai stabilitásával és viszonylag nagy faj;úlyával tűnik ki. Ezek a tulajdonságok többféle "elhasználás esetén is hosszabb ideig történő alkalmazást tesznek lehetővé. Az említett tulajdonságok 20 szakaszos eljárásoknál intenzív keverést és centrifugával veszteség nélküli egyszerű elválasztást tesznek lehetővé anélkül, hogy mechanikai igénybevétel, pl. kopás folytán veszteség lépne fel. Ezáltal szakaszos eljárásokban tiszta szűrletek állíthatók 25 elő, amelyek a végtermék kinyerésére alkalmazandó pótlólagos szűrés vagyis a 6-APS kinyerésénél további feldolgozás nélkül alkalmazhatók. A találmány szerint előállított hordozóhoz rögzített penicillin-aciláz lehetővé teszi, hogy a szűrést gyorsan 30 végezzük, mivel a szűrőfelületet eltömő igen finom szemcsés részecskék ki vannak küszöbölve. További előnyöket jelent a gyanta viszonylag nagy fajsúlya szakaszos eljárásban, amely egyben a gyanta gyors kiülepedését teszi lehetővé, így az eljárás befejezése 35 után a felülúszó oldat könnyen szivornyázással eltávolítható. Ezáltal is az eljárás kivitelezése egyszerűsíthető, mivel szakaszos eljárásnál a gyanta közvetlenül a reakcióedényben marad és a következő hasításnál alkalmazható. 40 A hordozóhoz rögzített penicillin-acilázt nem csupán szakaszos, hanem folyamatos eljárásokban pl. reakcióoszlopokban, ahol a gyöngyforma a szükséges nagy átáramlási sebességet teszi lehetővé, 45 is alkalmazhatjuk. Az enzimatikus hasításnál képződött 6—APS az enzimgyanta leválasztása után a reakcióoldatból ismert eljárással pl. az 1111 778 számú NSzK szabadalmi leírás szerint nyerhető ki és 4,3 pH-érték- 50 nél kristályosítható. A penicillin találmány szerinti hasításánál a szintén találmány szerint előállított hordozóanyaghoz rögzített penicillin-aciláz segítségével lényegesen magasabb 6-APS hozamok érhetők el, mint E. coli iszap alkalmazásánál, de a 55 hozamok a 2 157 970 sz. NSzK nyilvánosságrahozatali irat szerinti enzimgyanta alkalmazásához képest is növelhetők. így mint a 8. és 9. példában kimutatjuk, a 6-APS kb. 90%-os hozammal különíthető el. Az így előállított 6-APS gyakorlatilag "60 polimermentes, amelyek jelenlétével azonban a többi módszernél számolni kell. A fehérjék vagy polimerek által okozott allergen mellékhatások a találmány szerint előállított 6-APS esetében teljes mértékben kiküszöbölhetők. 65 A találmány szerint előállított hordozóhoz rögzített penicillin-aciláz többoldalú felhasználást tesz lehetővé hosszabb időn keresztül. Még hosszabb idő eltelte után is az enzimaktivitás gyakorlati szempontból teljesen megmarad. A példákban szereplő forráspontokat normál nyomáson határoztuk meg. 1 a) példa 70 g tetraetilénglikol-dimetakrilátot, 20 g metakrilsavat, 10 g maleinsavanhidridet és 1 g azo-izovajsavnitrilt 1 liter benzolban feloldunk és először 4 óra hosszat 60 C°-on polimerizálunk. Ezután hozzáadunk 1 g azo-izovajsavnitrilt és 200 ml 100-140 C° közötti forráspontú benzint, és 2 óra hosszat 70 C°-on, majd 2 óra hosszat 80 C°-on polimerizáljuk. A kapott por alakú polimereket 30—50 C° közötti forráspontú petroléterrel kimossuk és vákuumban szárítjuk. Hozam: 96 g Térfogatsúly: 8,8 ml/g Duzzadási térfogat vízben: 12,4 ml/g Fajlagos felület: 8,6m2 /g Savtartalom az anhidrid-csoportok elszappanosítása után = 3,85 milliekvivalens/g 1 b) példa 6 g 1 a) példa szerint előállított hordozógyantát 610 U penicillin-aciláz 150 ml vízben készült oldatában szuszpendálunk. 1 n nátriumhidroxid pH szabályzószer hozzáadása után 6,3 pH-értéket állítunk be és a szuszpenziót 20 óra hosszat 25 C°-on keverjük. A reakcióelegyet ezután G 3 üvegfritten szűrjük és 300-300 ml 0,05 mólos 7,5 pH-értékű 1 mólos nátriumkloridot tartalmazó, majd ugyanilyen de nátriumkloridmentes pufferoldattal mossuk. További mosással a kimutatható aktivitás már nem növekszik. A mosóoldatokat és a felülúszó részt egyesítjük és az enzimatikus aktivitást meghatározzuk. A nedves gyanta aliquot mennyiségében az enzimatikus aktivitást szintén meghatározzuk. Eredmény: Enzimatikus aktivitás (NIPAB-teszt) Kiindulási oldat: 610 U Felülúszó rész és mosóoldatok: 112U Hordozógyanta reagáltatás után: 561 U, vagyis az eredeti aktivitás 92%-a. A penicillin-aciláz enzimatikus aktivitását kolorimetriásan vagy titrimetriásan 0,002 mólos 6-nitro-3--(N-fenilacetil)-aminobenzoesavval (NIPAB) mint szubsztrátummal 7,5 pH értéken és 25 C°-on mérjük. A képződő 6-nitro-3-aminobenzoesav moláris extinkciós koefficiense E40S nm =9090. Az egység (U) megfelel egy perc leforgása alatt előállított 1 mikrómól szubsztrátumnak. 6
